载脂蛋白E
载脂蛋白E(Apo E)主要存在于CM、VLDL、IDL和部分HDL中, 正常人血浆Apo E浓度为0.03～0.05g/L。Apo E的浓度与血浆甘油三酯含量呈正相关。
一、结构
Apo E是一个含有299 个氨基酸结合有磷脂的糖蛋白, 其分子量为34kD。Apo E可以在各种组织中合成, 但以肝脏为主。首先合成的是含有317个氨基酸的前肽, 这个前肽在内质网中经过蛋白水解作用除去18个氨基酸的信号肽, 再经过糖基化作用和细胞外液的脱唾液酸作用形成成熟的Apo E。Apo E分泌入血后即转移到脂蛋白中, 并同它们一起代谢。
Apo E的一级结构是一条单多肽链, 其全部的氨基酸组成顺序已经被Apo E mRNA的cDNA分析所证实。其氨基酸组成上含有10%～12%的精氨酸(按其氨基酸克分子计算),故曾称为富含精氨酸载脂蛋白。有关Apo E的二级结构已基本弄清(图1-2-1), 对其三级结构也有部分了解(图1-2-2)。Apo E是一个多态性蛋白, 有三个常见的异构体 , 即E2、E3和E4。各种Apo E异构体的主要区别是氨基酸一级结构的不同, 这涉及到半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)的交换: E3含一个Cys(第112位); E4不含Cys, 但比E3多一个Arg(第112位); E2含2个Cys, 但比E3少一个Arg(第158位)。Apo E 的二级结构(图1-2-2)中含有较多的α-螺旋, 这种结构在去垢剂或脂类环境中仅有极微小的改变 , 是比较稳定的。同其他载脂蛋白(如AI、AII、CII)相比较, Apo E有易变的、 松散的、折迭三级结构。
图1-2-1. 载脂蛋白E的二级结构
图1-2-2. 载脂蛋白E氨基末端主要部分的三级结构
Apo E羧基未端的稳定区可能是主要的脂蛋白脂类结合区, 此区没有与LDL受体结合的活性。而Apo E氨基未端区具有很强的与LDL受体结合的能力。通过酶和化学切开的Apo E分子碎片基因研究表明, Apo E的受体结合区域存在于N端126-191氨基酸残基端区域之间。LaLazar等研究表明, Apo E的N端140-160氨基酸残基附近区域, 对于受体的结合是非常得要的。特别是这一部位的硷性氨基酸如精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)是Apo E结合受体所必需的。这一区域中仅一个氨基酸的取代就可影响受体的结合活性。用一些中性氨基酸分别取代136、140、150等位置上的碱性氨基酸, 可出现不同的受体结合活性, 约为正常的9%～25%(Apo E3为100%) 。 如果使 Apo E139位的色氨酸(Ser)变为Arg、149位的亮氨 酸(Leu)变为 甘氨酸(Ala), 却表现出结合活性的轻微增加。这一活性的改变与人类自然变异体的变化是很相似的。这已被有受体结合缺陷的变异体研究所证实。将分离出的E2、E3、E4分别与磷脂重组, 并检查其与人成纤维细胞的LDL受体的结合能力, 结果发现Apo E3和E4的磷脂复合物易与LDL受体结合, 两者结合力相同。而E2的磷脂复合物与受体的结合力降低 , 表现出受体结合缺陷。这说明发生在112位上的半胱氨酸(Cys)被Arg取代对E4 的受体结合活性无明显影响, 而158位的Arg被Cys取代则使E2的受体结合活性大为降低。上述结果表明158位的带正电荷的精氨酸可能为Apo E与受体结合所必需的。用巯基乙胺(cysteamine)处理Apo E, E2增加两个正电荷, 结果使受体结合活性增加, 也说明158位的重要性。通过对LDL受体的研究也证明了这一点, 在LDL受体结构区I含有成簇的带负电荷的氨基酸, 是Apo E带正电荷的氨基酸残基的特异结合部位。此外, 用抗结合部位的Apo E单克隆抗体研究也表明Apo E140-160 氨基酸残基为受体结合的残基。这一区域的结构包括: α-螺旋(131-150)、β转角(151-154)和β-折迭(155-162)。
Apo E除具有与LDL受体结合的能力外, 还可以与Apo E受体结合。Apo E受体只能与Apo E结合, 它只存在于肝脏。Apo E受体对LDL受体抗体有交叉免疫性 , 但Apo E受体抗体不与LDL受体反应。这说明Apo E受体中有特殊的抗原决定簇, 这种抗原决定簇在LDL受体中并不存在。
人Apo E基因已被分离出来, 基因定位于19号染色体上。Apo E基因由3597个核苷酸组成, 含有4个外显子和3个内含子。四个外显子的长度分别为44、66、193 和860bp; 三个内含子的长度分别为760、1092和582bp。相对应的Apo E mRNA由 1169个核苷酸组成。
二、生理功能
(一)、组成脂蛋白, 是CM、VLDL、IDL和部分HDL的结构蛋白;
(二)、作为配体与LDL受体和Apo E受体结合;
(三)、具有某种免疫调节作用, 这是因为在淋巴细胞表面有Apo E免疫调节受体,而含Apo E的脂蛋白能与淋巴细胞免疫调节受体结合, 可使淋巴细胞对促进细胞分裂的刺激发生对抗, 这可能是脂蛋白和受体的结合抑制了淋巴细胞活化所需要的早期转化过程, 如对钙的摄取、 磷脂酰肌醇循环和环核苷酸代谢等。 这些观察提示Apo E在免疫反应中可能有一定的调节作用。
(四)、参与神经细胞的修复。
三、 多态性
人类Apo E有三种主要的异构体(E2、E3、E4), 他们之间的差别仅在于112 位和158位上的单个氨基酸不同, 即半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)相互取代(E2为112 位和158位上均是Cys, E3为112位上是Arg158位上是Cys, 而E4则为112位和158位上均是Arg)。这种单个氨基酸不同造成的异构体就是由于Apo E基因的多态性所决定的。已知的常见Apo E异构体是由三个等位基因编码, 人群中有六种表型, 即三种纯合子如E2/E2、E3/E3和E4/E4以及三种杂合子如E4/E3、E4/E2和E3/E2。在不同的人群中三个不同的Apo E等位基因(Ε2、Ε3、Ε4)分布频率存在不同, 因而决定了不同人群中Apo E表型的频率差异(表1-2-2)。
表1-2-2. 不同正常人群中Apo E表型分布和Apo E等位基因频率
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表 型 等 位 基 因
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国家 N 2/2 2/3 3/3 3/4 4/4 4/2 Ε2 Ε3 Ε4
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北京 95 0 9.47 78.96 9.47 1.05 1.05 0.053 0.883 0.064
湖南* 103 0.95 8.70 77.60 10.8 0.95 0 0.063 0.874 0.063
日本 110 0 4.45 79.09 15.45 0.91 0 0.023 0.891 0.086
日本 92 1.09 5.43 75.00 15.22 3.26 0 0.038 0.853 0.109
日本 100 0 12.00 71.00 15.00 1.00 1.00 0.065 0.845 0.090
新西兰 426 1.41 19.95 51.41 25.12 0.94 1.17 0.120 0.720 0.160
美国 1209 0.58 11.83 63.28 18.78 3.14 1.93 0.075 0.786 0.135
西德 1000 0.80 11.00 62.70 20.20 2.30 3.00 0.078 0.783 0.139
英国 400 0.50 12.75 58.25 24.75 1.00 2.75 0.083 0.770 0.147
加拿大 102 1.96 9.80 61.77 20.59 3.92 1.96 0.078 0.770 0.152
荷兰 247 0.81 16.20 57.49 19.43 4.05 2.02 0.099 0.753 0.148
法国 223 0.89 20.63 55.16 17.49 2.24 3.59 0.130 0.742 0.128
芬兰 615 0.33 6.67 53.98 31.87 6.34 0.81 0.041 0.732 0.227
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*基因型
在血脂正常的人群中, 各Apo E 表型者的血浆胆固醇水平高低依次是 E4/E4> E4/E3 > E4/E2 > E3/E3 > E3/E2 > E2/E2。这种Apo E 表型影响个体间血浆胆固醇水平的作用并不受环境和其他遗传背景的干扰。有人发现Apo E2和Apo E4携带者的血浆胆固醇浓度平均较Apo E3携带者相差13-30mg/dl。Apo E2的"降胆固醇"作用是Apo E4的"升胆固醇"作用的2-3倍。 目前尚未发现任何其他的等位基因能如此显著地影响正常人群的血浆胆固醇水平。
人群中甘油三酯水平与Apo E表型间亦有较明确有关系, 即E2/E2 、 E3/E2 、E4/E3和E4/E2者的血浆甘油三酯水平明显高于E3/E3者。同时还发现E4/E4者 HDL-C浓度明显 低于E3/E3者。
Apo E的多态性也可影响各类高脂蛋白血症患者的血脂和脂蛋白水平, 最典型的范例是 Apo E2/E2 表型与家族性异常β脂蛋白血症 ( familial dysbetalipoproteinemia, FD)相伴随。绝大多数FD患者为Apo E2/E2表型, 故后者被认为是FD发病的必备条件。有研究表明, Apo E2/E2表型者, 无论其血浆总胆固醇浓度的高低如何,都伴有VLDL结构异常(富含胆固醇酯)、血浆IDL浓度升高和 LDL浓度降低。
体内代谢研究结果表明, Apo E2和E4的代谢不同于Apo E3。将用同位素标记的Apo E2和Apo E3注射入Apo E3/E3的个体内, 发现Apo E2与VLDL、IDL和HDL 结合较少, 而是较多地存在于HDL中或游离在血浆中, 并且 E2 自身的分解代谢缓慢。 而Apo E4的体内代谢情况则恰恰相反。Apo E 各表型在体内的代谢不同与临床上测定各表型者血浆Apo E浓度有一致的关系: E2/E2者血浆Apo E浓度最高, E3/E3者居中,而E4/E4者最低。
关于Apo E表型调节体内血浆脂蛋白代谢的机理, 目前认为是由于Apo E2 与脂蛋白受体结合的能力低下, 引起CM和VLDL残粒分解代谢延缓, 造成这些残粒在体内蓄积; 同时也因IDL向LDL转化减少, 造成血浆中IDL浓度增加和LDL浓度低下。这些改变使CM和VLDL残粒进入肝细胞内代谢减少, 肝细胞内游离胆固醇含量减少, 反馈调节性地引起肝细胞表面上的LDL受体上调(数目增加), 因而加速LDL在体内的分解代谢, 使血浆LDL浓度进一步低下。如果没有其他可引起血脂升高的遗传和/或环境因素并存, Apo E2的尽效应则是使血浆甘油三酯水平升高, 而使血浆胆固醇水平降低。与此相反, Apo E4与受体的结合能力则相对较强, 因而使CM和VLDL残粒代谢增速,使IDL向LDL的转化也增多。其结果是引起血浆中CM残粒、VLDL和 IDL水平下降,而LDL水平升高。由于正常情况下, 体内CM和VLDL残粒水平很低, 故Apo E4 对这些脂蛋白残粒的影响难以被察觉。所以, Apo E4的尽效应是造成血浆胆固醇水平升高,而对血浆甘油三酯水平的影响则不大。
此外, Apo E表型还可能通过其他途径来影响体内血脂水平。有人发现, Apo E4携带者, 小肠吸收胆固醇增加。所以, Apo E4携带者采用饮食疗法治疗高脂血症获益最明显。另有实验发现, Apo E2携带者体内脂肪酸合成明显高于Apo E3者, 并认为这种体内脂肪酸合成增加是Apo E2者易伴发高甘油三酯血症的主要原因。
各种Apo E表型者罹患冠心病的危险性可能不相同。 芬兰人心肌梗塞的患病率居世界首位, 其Apo E4频率(0.227)分布较高, 而Apo E2频率(0.041)分布较低; 亚州人冠心病患病率低, 而Apo E4等位基因频率(0.064)也较低。 这些结果似乎支持各地区冠 心病患病率不同与Apo E表型分布不同有关。
有关Apo E表型与冠心病关系的研究结果很不一致, 可能是由于被研究者常同时存在高胆固醇血症、高血压病、糖尿病和吸烟等冠心病的主要危险因素。若能在无危险因素存在的中青年心肌梗塞存活者中进行Apo E等位基因频率分析, 则可望获得较为有说服力的结果。
调查12866例存在冠心病高危因素的中年男性, 发现冠心病组Apo E3/E3频率分布为0.462, 较对照组(0.67)显著为低, 提示Apo E3/E3表型者不易患冠心病。而冠心病组Apo E4/E3分布为0.333, 较对照组(0.206)显著为高, 提示Apo E4/E3表型者有易患冠心病的倾向。经对比线性回归单因素分析, 提示Apo E3/E2 、 E4/E3 和E4/E4 表型者患冠心病的危险性增加。 国内的研究结果亦支持冠心病患者中 Apo E4/E4的频率分布较高。
观察100例缺血性脑卒中的男性病人, 发现其Apo E4 等位基因的频率明显高于对照组, 故认为Apo E等位基因携带者很可能具有缺血性脑血管疾病的遗传易感性。然而, 另一组研究则提示Apo E2等位基因可能是缺血性脑卒中的危险因素。
此外, 还有几组研究报道在老年性痴呆患者中Apo E4/E4表型者频率异常高 , 提示Apo E的多态性也可能与神经系统疾病之间存在一定的关系。
四、 突变
Apo E基因突变可引起许多Apo E的异构体, 目前已报道的有近20种, 其中多数可伴随有高脂蛋白血症(见表1-2-3)。
表1-2-3. 载脂蛋白E异构体
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表型 氨基酸改变 相对电荷 受体亲和力 高脂蛋白血症
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E7 244 Glu→Lys +4
245 Glu→Lys
E5 Japan 3 Glu→Lys +2 188 II
E5 Canada 13 Glu→Lys +2
E5 84 Pro→Arg +2 100 II
112 Cys→Arg
E4 112 Cys→Arg +1 100
E3 99 Ala→Thr 0
152 Ala→Pro
E3 112 Cys→Arg 0 IV
251 Arg→Cys
E3-Leiden 121-127重复 0 25 III
E2 112 Cys→Arg 0 <4 III
142 Arg→Cys
E2 158 Arg→Cys -1 <2 III
E2 145 Arg→Cys -1 45 III
E2 145 Lys→Gln -1 40 III
E2 236 Val→Glu -1
E2Chrischurch 136 Arg→Ser -1 40 III
E2Dunedin 228 Arg→Cys -1 100 IV Ⅴ
E1Hrrisburg 146 Lys→Gln -2 III
E1 127 Gly→Asp -2 III
158 Arg→Cys
E1 Bethesda ? -2 III
E缺乏 内含子拼接缺陷 III