普罗布考对高脂兔血栓调节蛋白的影响

普罗布考对高脂兔血栓调节蛋白的影响
赵水平洪绍彩邓平吴智鸿
[摘要] 目的观察普罗布考对动脉粥样硬化斑块形成及血栓调节蛋白（TM）的影响。方法 16只新西兰大白兔给予高脂饲养8周后，随机分为：①淀粉组：饲以高脂饲料及淀粉（500 mg/kg.d-1）；②普罗布考组：在饲以高脂饮食基础上给予普罗布考（500 mg/kg.d-1）；③正常对照组：给予普通饮食（n =8）。动态观察血脂和TM的变化，第14周末处死动物进行主动脉的病理学检测。结果① 高脂饮食8周后，总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平明显升高，普罗布考治疗6周后上述指标的水平可明显降低；②高脂饮食8周后主动脉可见明显的斑块形成，普罗布考组粥样硬化斑块的面积（51.54%±8.32%）较淀粉组（84.81%±9.35%）明显减少，P＜0.01；③普罗布考组动脉内膜厚度[（0.58±0.17）mm]较淀粉组[(1.62±0.28)mm]明显减少，P＜0.01。④正常饮食兔的TM水平很低[（0.65 ±0.25）ng/ml]，与淀粉组[（9.82 ±1.55）ng/ml]比较,普罗布考组TM水平[（4.31± 1.45）ng/ml]明显降低，P＜0.01；血浆TM水平与动脉硬化斑块的面积成正相关（r =0.72,P =0.008）。结论普罗布考延缓动脉粥样硬化斑块的形成作用可能与降低TM水平，影响凝血功能有关。
[关键词] 普罗布考；粥样硬化；内皮；血栓调节蛋白

Effects of Probucol on the Plaques Formation of Aorta and the Thrombomodulin in Hypercholesterol-fed Rabbits. Zhao shui-ping, Hong shao-cai, Deng ping, et al. Department of Cardiology, The SecondXiangyaHospital of Central South University, Changsha, Hunan 410011, PR China
[Abstract] Objective To explore the effects of probucol on the plaques formation of aorta and soluble thrombomodulin in hypercholesterol-fed rabbits. Methods 16 male New Zealand white rabbits were fed with 1% cholesterol, 7.5% protein, 8% lard diet for 8 weeks, and then were randomly divided into two groups: (1) starch group: maintained cholesterol and starch (500mg/kg/d) diet for 6 weeks; (2) probucol group: the same cholesterol diet supplemented with (500mg/kg/d) probucol for 6 weeks. And control group was fed with normal diet for 14 weeks. The changes of serum lipid profile and thrombomodulin (TM) concentrations were detected every two weeks, and the histopathological changes of the aortas were detection at the end of the study. Results After 6 weeks treatment of probucol, the levels of total cholesterol (TC), high-density ipoprotein cholesterol (HDL-C), and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) were reduced significiantly compared with the starch group, (all P<0.05). The areas of the plaque (51.54±8.32%) and the intima (0.58±0.17mm) of the aorta were ameliorated in probucol group compared with the starch group (84.81±9.35%, 1.62±0.28mm, respectively). The base concentrations of TM in the three groups were very low, and probucol significantly reduced the level of TM (3.25± 0.52ng/ml)compared with starch group (7.56 ±0.62ng/ml). The concentration of TM was positively associated with the plaques areas of aorta (r =0.72,P =0.008). Conclusion Probucol decreased the plasma cholesterol and TM concentrations and protected the endothelial function, which may inhibite the formation of plaques of aorta in cholesterol-fed rabbits.
作者单位：410011 湖南长沙，中南大学湘雅二医院心内科
作者简介：赵水平教授博士研究生导师中华心血管病杂志编委主要从事血脂与动脉粥样硬化的研究。洪绍彩，副主任医师，博士研究生，本文通讯作者，联系电话：13787258508，E-mail:hongshaocai@sina.com,传真：0731-4895989。
[Key words] probucol; atherosclerosis; endothelium; thrombomodulin

血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)是一种分布于静脉、动脉和毛细血管内皮细胞表面的质膜蛋白。Blann等认为TM是血管内皮损伤的重要参数[1]。普罗布考是一类作用独特的抗动脉粥样硬化药物，国外的临床研究结果表明普罗布考可明显改善血管内皮功能[2，3]，推测其抗动脉粥样硬化作用与改善内皮功能有关。本研究通过建立动脉粥样硬化兔模型，观察普罗布考对主动脉斑块形成和血浆可溶性血栓调节蛋白（TM）的影响，探讨普罗布考抗动脉粥样硬化的机制。
材料和方法

高脂模型的建立和普罗布考干预

选取24只3月龄、体重2.5±0.5kg的新西兰大白兔（清洁级动物，由中南大学湘雅二院实验动物中心提供）单笼饲养1周后，记录体重并进行基线血脂和TM测定。然后随机给16只兔高脂饮食，其余8只正常饮食。高脂饮食配方参照余艳辉等[4]报道，具体如下：1%胆固醇、7.5%的蛋黄粉、8%的猪油，余为正常粗颗粒饲料。每兔每天进食120克高脂饲料，自由饮水。第8周末再次称体重并测量血脂和TM水平。第9周开始在高脂饮食基础上随机给予普罗布考(500mg/kg.d-1，河北承德颈复康药业集团提供，普罗布考组，n=8)药物饮食或淀粉(500mg/kg.d-1，淀粉组，n=8)。此后每2周抽血1次，测定TM的水平，第14周末在深麻醉状态下处死动物。
2．血脂和脂蛋白的测定
测定饲养前、第8周和第14周末的血脂水平。在日立7600-020全自动生化仪上测定血浆总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和甘油三酯的浓度。各指标均采用盲法测定，批间、批内变异系数控制在5.5%和3.5%以内。

主动脉斑块的HE染色和苏丹III染色

将主动脉从根部分离至髂动脉分叉处离断，并纵行剖开，取升主动脉近端1.5cm放入4%的多聚甲醛溶液中固定4小时后，经梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋切片,切片厚5μm，连续切片。行HE染色作组织病理学诊断，测定主动脉的内膜厚度。主动脉的其余部分行苏丹III染色，测定主动脉脂纹脂斑和粥样斑块的面积，计算其占主动脉总面积的比例。
4．酶联免疫吸附法（ELISA）测定血浆TM的含量：
采用ELISA测定0、8、10、12、14周血浆中TM（美国MARKET公司产品）的水平，检测灵敏度为1 pg/ml。严格按试剂盒和酶标仪说明书提示的步骤进行操作，批内、批间的变异系数均<10%,每份样品均设复孔。
5．统计学分析
所有试验数据以±s表示，输入SPSS10.0统计软件包进行统计分析，对主要指标进行正态性检验，治疗前后的比较采用配对资料t检验，采用one-way ANOVA 分析来进行三组间比较。P＜0.05为差异有显著性。
结果
1．普罗布考对血脂和体重的影响
三组兔0周、8周及14周时血脂和体重的变化如表1所示。高脂饮食8周后，TC、HDL-C和LDL-C明显升高，P均＜0.01。继续高脂饮食至14周时血浆胆固醇水平仍较高，但与8周时比较无显著性差异。普罗布考治疗6周后明显降低TC、LDL-C和HDL-C，P均＜0.01。普罗布考对体重和甘油三酯水平无明显的影响。

病理学检查

肉眼观察:正常饮食组主动脉内膜光滑、白色、平坦,未见明显苏丹III着色区。高脂饮食8周后苏丹III染色可见主动脉有明显的淡黄色的脂纹和粥样斑块形成,斑块直径分别为0.1～2.0mm不等。实验结束时淀粉组主动脉内膜苏丹III染色显示阳性区广泛,有明显粥样斑块形成,呈灰黄色颗粒状、息肉状、不规则或椭圆形,或互相融合成条索状与动脉纵轴平行。普罗布考治疗6周后可见斑块面积明显减少。病变以主动脉弓段最明显,胸段次之,腹主动脉少见，见图1。
光镜检查:正常饮食组主动脉内膜厚度（0.28±0.18）mm,管壁薄,各层结构正常。淀粉组内膜明显增厚[（1.62±0.28）mm],内膜表面内皮细胞肿胀或脱落并有大量泡沫细胞蓄积。普罗布考组[（0.58±0.17）mm]内膜虽增厚但比淀粉组明显减轻，P =0.012。见表2，图2。
表1普罗布考对血脂和脂蛋白的影响（mmol/L，±s）

	TC	LDL-C	HDL-C	TG
正常对照组 0周	0.87±0.43	0.28±0.24	0.53±0.21	0.89±0.64
8周	0.88±0.31△△	0.30±0.25△△	0.56±0.25△△	0.96±0.48△△
14周	0.96±0.50△△	0.34±0.35△△	0.52±0.20△△	1.10±0.34
淀粉组 0周	0.80±0.24※※	0.22±0.18※※	0.52±0.24※※	0.77±0.32※※
8周	27.65±0.71	23.23±3.33	2.27±1.36	1.64±1.45
14周	26.73±1.33	22.52±3.24	1.86±0.27	1.89±1.48
普罗布考组 0周	0.82±0.23※※	0.22±0.18※※	0.51±0.23※※	0.74±0.19※※
8周	25.75±4.47	22.56±4.80	2.05±0.99	1.56±1.38
14周	18.63±2.34※※△△	17.53±2.73※※△△	0.95±0.18※※△	2.03±1.80

注：与8周时比较※ P＜0.05, ※ ※P＜0.01; 与淀粉组比较△ P＜0.05，△△ P＜0.01。
表2 各组兔的主动脉内膜厚度及斑块面积

组别	主动脉总面积（cm2）	主动脉内膜厚度(mm)	脂纹及斑块面积(cm2)	脂纹及斑块面积/主动脉总面积（%）
正常饮食组	9.27±0.18	0.28±0.18	0.00±0.00	0.00±0.00
淀粉组	9.68±0.09	1.62±0.28	8.21±0.56	84.81±9.35
普罗布考组	9.41±0.16	0.58±0.17※※△	4.86±0.34※※△	51.54±8.32※※△

注：与淀粉组比较，※ ※P＜0.01; 与正常对照组比较，△ P＜0.01。
3. 各组兔血浆TM在实验中的变化

三组兔血浆基础TM水平很低，组间比较无显著差异。高脂饮食8周后TM水平有升高趋势，但与基础值比较无统计学差异。第10周时开始明显升高，P＜0.05。第14周时达最高水平，普罗布考治疗4周后即可明显降低血浆TM的水平，P＜0.01，见表3。血浆TM水平与主动脉斑块的面积成正相关（r =0.72,P =0.008）。

注：箭头所指红色区为粥样硬化脂纹和斑块。
A，正常饮食组；B，高脂饮食8周后；C，淀粉组；D，普罗布考组。
图1 各组兔主动脉苏丹III染色

注：箭头所示为主动脉内膜，实线区域为中膜。A，淀粉组；B，普罗布考组；C，正常饮食组
图2 各组兔主动脉内膜（HE染色）

表3 各组兔血浆TM水平在实验中的变化

分组	0 W	8 W	10 W	12 W	14 W
正常组（n=8）	0.51± 0.22	0.58 ±0.24	0.54 ±0.26	0.58 ±0.21	0.61 ±0.25
淀粉组（n=8）	0.51 ±0.20	0．62 ±0.25	1．64 ±0.33※	4．32 ±0.43※※	7．56 ±0.62**
普罗布考组（n=8）	0.50± 0.26	0．59 ±0.28	1．06 ±0.32	2．02 ±0.43※#	3．25±0.52**#

注：与0周时比较，※ P＜0.05, ※ ※P＜0.01; 与淀粉组比较，#P＜0.01
讨论
动脉粥样硬化的发病机制十分复杂，但血管内皮功能的损伤可能是中心环节。血管内皮功能损伤后体内的凝血系统激活，血液处于促凝状态，易形成血栓，从而导致临床心血管事件的发生[6]。现已证明，调脂、抗氧化、抗炎症等药物均具有抗动脉粥样硬化作用[7]。
普罗布考是一种作用独特的降血脂药物，具有强大的抗氧化作用。临床研究观察到普罗布考可使冠心病的发生率明显降低[8]。本研究结果显示高脂饮食8周后血浆胆固醇水平明显升高，主动脉可见明显的斑块和脂纹形成，继续高脂饮食至14周后可见主动脉的脂纹和斑块的形成进一步增多，普罗布考干预6周后血浆胆固醇含量明显降低，主动脉斑块的面积明显减少，内膜厚度明显减轻。证明普罗布考具有延缓动脉粥样硬化斑块形成的作用，更长的时间的治疗可能使斑块消退。这一作用可能与普罗布考的降脂和抗氧化作用有关[9-11]，也可能通过抑制平滑肌细胞的增殖[12]或其他途径而起作用。
TM有两种形式,一是跨膜存在于内皮细胞表面,使血管壁保持抗凝的状态；二是以可溶性形式存在于血浆和尿中。正常生理情况下TM通过抑制血栓素和细胞的黏附而起抗凝、抗纤溶、抗炎作用，在动脉粥样硬化的过程中起重要作用[13]。在内皮细胞发生炎症等病理过程或损伤后TM被释放入血并表现为可溶性TM抗原。因此TM是血管内皮细胞损伤的重要标志物之一[1]。最近的研究表明,TM与冠心病之间存在着密切关系，可作为动脉粥样硬化易患性的一个预测指标[14],而且与心血管药物有一定的关系[15]。本研究结果显示正常对照组TM的含量很低，高脂饮食8周后，血浆胆固醇已经明显升高，但TM至第10周时才明显升高，实验结束时达峰值，这些结果提示高胆固醇水平可损伤血管内皮[7]，促进动脉粥样硬化的形成。普罗布考干预6周后可明显降低血浆胆固醇和TM含量。提示普罗布考确实具有保护血管内皮功能的作用[2]，可防止血栓的形成。
普罗布考降低TM可能与以下因素有关：第一，与其降脂作用有关。由于高胆固醇血症是内皮损伤的重要因素[7]，普罗布考的降脂作用使内皮的损伤减轻。国外的临床研究结果也表明，他汀类降脂药物使高脂血症患者的血浆TM水平降低[16]。第二，与其抗氧化作用有关。目前研究结果表明，氧化应激参与了内皮功能损伤的病理过程[10，17]。普罗布考通过其抗氧化作用保护血管内皮功能已经得到多个研究的证实[2，3]。第三，直接促进血管再内皮化作用。Lau AK等 [18] 通过球囊损伤兔主动脉模型发现，普罗布考可促进高脂饮食兔损伤的主动脉内皮再生，使损伤的血管内膜再内皮化，改善血管内皮功能。第四，其他机制：普罗布考可通过其他生物学上的作用保护次氯酸所致的内皮损伤[3]。
本研究结果表明，降脂及抗氧化药物普罗布考具有保护内皮功能，抑制血栓形成和延缓动脉粥样硬化形成的作用。如普罗布考对人体也产生相同的作用，则普罗布考的应用将为冠心病的预防及治疗开辟广阔的前景。
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