普罗布考对高脂兔肝功能及胆汁酸受体表达的影响
洪绍彩,赵水平,刘琼
摘要： 目的 观察普罗布考对高脂兔肝功能及肝脏胆汁酸受体(FXR)mRNA表达的影响。方法 16只新西兰大白兔给予高脂饲料饲养8周后，随机分为：（1）高胆固醇组(n=8)：继续饲以高脂饲料6周；（2）普罗布考组(n=8)：在饲以高脂饲料的基础上给予1%普罗布考,共6周。正常饮食组(n=8)：另选8只普通饮食14周的兔为对照组。动态观察肝功能变化，实验结束后，采用半定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法测定肝脏FXR mRNA的表达。结果 ①普罗布考治疗6周后，血清总胆固醇，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）均明显下降；②普罗布考组谷丙转氨酶（ALT），（45.34±14.91）U/L及谷草转氨酶（AST），（49.68±15.84）U/L]较高胆固醇组[ALT（67.20±17.34）U/L,AST（81.36±22.97）U/L]均明显降低，P均<0.01；③与高胆固醇组比较，普罗布考组血清总胆汁酸（TBA）(46.11±18.58) mmol/L vs(56.34±20.67)mmol/L,总胆红素（T-BIL）均明显降低，为(3.04±1.06) mmol/L vs (5.34±1.38) mmol/L, P均＜0.05；④肝脏FXR mRNA 的表达明显增加，为0.86±0.05 vs0.62±0.06，P=0.018。结论 普罗布考具有护肝作用，其降低HDL-C可能与上调FXR mRNA的表达有关。
关键词：普罗布考；胆汁酸；胆固醇；胆汁酸受体；肝功能
中图分类号：589.2 R333.4 R972+.6 文献标识码：A 文章编号：1007-5410（2006）

Effects of probucol on liver function and expression of farnesoid X receptor in livers from hypercholesterolemic rabbits HONG Shao-Cai，ZHAO Shui-Ping，LIU Qiong. Department of Cardiology, The Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha, Hunan 410011, China
Abstract：Objective To explore the effects of probucol on liver functions and expression of farnesoid X receptor (FXR) in livers of hypercholesterolemic rabbits. Methods 16 male New Zealand white rabbits were fed with 1% cholesterol, 7.5% protein, 8% lard diet for 8 weeks. Then
作者单位：中南大学湘雅二医院心内科， 湖南，长沙 410011。
作者简介：洪绍彩（1971-），女，汉族，广西北海人，1994年7月毕业于广西医科大学，博士，副主任医师，主要从事心血管内科临床工作。
they were randomly divided into two groups: (1) high cholesterol group: maintained high-
cholesterol diet for 6 weeks; (2) probucol group: the same cholesterol diet supplemented with 1%probucol for 6 weeks. Control group was fed with normal diet for 14 weeks. FXR mRNA expression were evaluated by RT-PCR. Results Compared with control group, rabbits fed with
high-cholesterol diet showed higher levels of serum total cholesterol (TC), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and HDL-C, all of which were significantly reduced by probucol. Compared with high cholesterol group, the levels of alanine transaminase [ALT,(45.34±14.91）U/L vs （67.20±17.34）U/L, P<0.01], aspartate transaminase [AST,（49.68±15.84）U/L vs （81.36±22.97）U/L, P<0.01], total bile acid [TBA,(46.11±18.58)mmol/L vs (56.34±20.67)mmol/L, P=0.042] and total bilirubin [T-BIL, (3.04±1.06)mmol/L vs (5.34±1.38)mmol/L, P=0.021] were significantly dropped after six weeks treatment with probucol. The mRNA expressions of FXR in liver were up-regulated in probucol group as compared with high cholesterol group (0.86±0.05 vs 0.62±0.06, P=0.018). Conclusions ?Probucol can improve liver function, and the reduction of HDL-C may be due to down-regulated FXR mRNA expression in liver.
Key words probucol; bile acid; cholesterol; farnesoid X receptor；liver function

胆汁酸的合成及排泄是胆固醇排出体外的主要通路，在胆固醇的代谢调节中发挥着重要作用，也成为治疗高脂血症的潜在靶点。最近法尼酯衍生物X受体(farnesoid X receptor, FXR)被证明是一种胆汁酸受体和胆汁酸生物合成的生物感受器，参与机体胆固醇的代谢调节[1,2]，在维持体内胆固醇的稳定中起重要作用。目前药物对FXR影响的研究甚少。普罗布考是一种调脂兼抗氧化药物，国外有临床研究发现普罗布考具有良好的降血脂和护肝的双重作用，治疗6个月后可明显降低脂肪肝患者的转氨酶[3]，但其作用机制尚不清楚。本研究观察了普罗布考对高脂兔血脂、肝功能及肝脏FXR mRNA表达的影响，探讨其降低高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的可能机制。
1．材 料 和 方 法
1.1实验动物及试剂
新西兰纯种雄性大白兔购自中南大学湘雅二医院实验动物中心，体重2.5±0.5公斤，清洁级动物。TaqDNA聚合酶及各种半定量逆转录多聚酶链式反应（ RT-PCR）试剂购自美国Promega 公司。TRIzol购自Introvigent公司。FXR及磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物由北京奥科生物工程公司设计并合成，其他试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 高脂兔模型建立和普罗布考干预? 选取24只3月龄的健康纯种雄性新西兰大白兔单笼饲养1周后，记录体重并进行基线血脂和肝功能分析。然后随机给16只高脂饮食，其余8只正常饮食（正常饮食组）。高脂饮食配方参照余艳辉等人[4]，具体如下：1%胆固醇、7.5%的蛋黄粉、8%的猪油，余为正常粗颗粒饲料。每兔每天进食120克高脂饲料，自由饮水。第8周末再次称体重并测量血脂和肝功能。第9周开始在高脂饮食组随机给予含1%普罗布考的药物饲料（普罗布考组，n=8）或单纯高脂饮食(高胆固醇组，n=8)。第14周末处死动物，取正中叶肝组织约2克，立即置液氮中保存。
1.2.2 血脂和肝功能的检测 ?高脂饲养前、第8周和第14周末，经兔耳中央动脉取空腹血2ml，留取血清，在日立7600-020全自动生化仪上测血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、三酰甘油（TG）、HDL-C、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆汁酸（TBA）和总胆红素（T-BIL）的浓度。
1.2.3 肝组织总RNA的提取和RT-PCR反应? 利用TRIzol试剂盒抽提肝脏总的RNA并逆转录成单链DNA，FXR上游引物序列为5’TGA ACC TGG AAG CTG TAA GAG C 3’，下游引物序列为5’TCG TAG TCT GAG GGA GGC AAG 3’，扩增长度256bp。GAPDH引物序列上游：5’ GGA? GCC? AAA? AGG? GTC? ATC? 3’，下游5’CCA? GTG? AGT? TTC? CCG? TTC? 3’，扩增片段346bp。FXR和GAPDH引物同体系以同样的反应条件扩增：94℃预变性4min，94℃、60s，55℃、60s，72℃、1min20s，共38循环，72℃延伸10min。取PCR产物6μl经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色、照相并经光密度仪扫描分析，以内对照光密度值进行标准校正，计算FXR产物的相对量。
1.3 统计学处理
应用SPSS10.0统计软件包进行统计分析，所有指标用±S表示，对主要指标进行正态性检验，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异具有显著性。
2．结 果
2．1普罗布考对血脂和脂蛋白的影响
3组兔0周、8周及14周时血脂及体重的变化见表1。高脂饮食8周后，TC、LDL-C和HDL-C均明显升高，P均＜0.01。第14周时上述指标略有下降，但与8周时比较差异无显著性。普罗布考干预6周后明显降低TC、LDL-C和HDL-C，降幅分别为27.5%，22.3%，53.7%，P均＜0.01。普罗布考对TG和体重无明显影响。实验过程中3组兔体重均增加，但组间比较无显著性差异。
表1 治疗前后各项生化指标的变化(±s)

注：BW：体重。与8周时比较，※ P＜0.05，※※ P＜0.01; 与高胆固醇组比较，﹟P＜0.01。
2.2 普罗布考对肝功能的影响
3组兔肝功能的基础水平无显著性差异，高脂饮食8周后，AST、TBA和T-BIL的含量均明显升高，并在14周时达高峰。ALT在8周时变化不明显，14周时明显升高。与高胆固醇组比较，普罗布考组ALT和AST均明显下降，P均＜0.01；TBA和T-BIL明显下降，P值分别为0.042和0.021。
表2 普罗布考对肝功能的影响 (±s)

注：与0周时比较，※ P＜0.05, ※ ※P＜0.01; 与高胆固醇组比较，﹟P＜0.05，﹟﹟P＜0.01。
2.3普罗布考对肝脏FXR mRNA表达的影响
正常饮食组、高胆固醇组、普罗布考组肝脏FXR的mRNA相对表达量分别为0.55±0.06，0.62±0.06和0.86±0.05（图1）。与高胆固醇组比较，普罗布考明显上调FXR mRNA的表达，P=0.018。
FXR （256 bp） 
GAPDH (346 bp)
M 1 2 3 4 5 6 M
图1 普罗布考对肝脏FXR mRNA表达的影响
注：M：标准分子量; 1，2：正常饮食组；3，4：高胆固醇组；5，6：普罗布考组
3．讨论
胆汁酸由胆固醇转变而来,是肝脏清除体内胆固醇的主要方式[5]。胆汁酸首先在肝细胞内合成,然后分泌入胆汁,随胆汁排至肠腔内,在肠管内大部分胆汁酸被重吸收入血,重吸收的胆汁酸经门静脉入肝,被肝细胞所摄取,再随胆汁排入肠腔,形成胆汁酸的“肠肝循环”。因此肝脏在胆汁酸代谢中占重要地位,肝细胞与胆汁酸的生物合成、分泌、摄取、加工转化都有密切关系,当肝细胞损伤或胆道阻塞时都会引起胆汁酸代谢的障碍,导致血清胆汁酸含量升高[6-8]。
胆红素是血红素在体内分解代谢的主要产物,肝细胞不断地将胆红素摄取、结合、转化及分泌,保证了血浆中的胆红素不断地被清除。当肝脏或/和胆道出现疾病时,胆红素和胆汁酸的代谢或/和循环受到破坏,血清中的T-BIL和TBA水平也随之升高[7，8]。在正常情况下胆汁酸已经对肝脏造成较大负荷,一旦肝细胞病变,胆汁酸很容易升高 [9-10]。本研究发现高脂饮食8周后，血清胆固醇含量明显升高，TBA和T-BIL含量随之明显增加，与既往的研究结果相符[11]。提示随着体内脂质含量的增加，胆汁酸池也随之扩大，TBA和T-BIL对调节胆固醇的代谢均有影响。另一方面，TBA和T-BIL含量的增加提示高胆固醇血症已经使兔子的肝功能受损。
胆汁酸受体FXR是孤儿核受体超家族中的一员，主要在肝脏、肾脏和小肠表达[1,2]。FXR是内源性胆汁酸的感受器，最近的研究结果表明，FXR可以调节胆汁酸的合成、转运、吸收，以及胆固醇的逆向转运，对维持胆固醇的代谢平衡有重要的调节作用[1,2,12]。FXR与胆汁酸具有高度的亲和力，二者结合后可以阻遏编码胆固醇7α羟化酶（合成胆汁酸的限速酶）的基因的转录，并激活编码回肠胆汁酸结合蛋白（胆汁酸的转运蛋白）的基因表达[13,14]。本研究结果表明普罗布考干预后血清胆固醇、TBA水平明显降低，肝功能明显改善，同时使肝脏FXR的表达增加，使肝细胞分泌胆汁酸增加，促进胆汁酸经肠道的排泄，减轻了胆汁酸对肝脏的损害。FXR表达增加使胆固醇转变为胆汁酸的作用增强，促进了体内胆固醇经肝脏的排泄，由于肝脏合成胆汁酸的主要原料来自HDL中的胆固醇[15]，胆汁酸形成的增加则加速了HDL中胆固醇的转移，这可能是普罗布考明显降低血清HDL-C的原因之一。
临床上观察到普罗布考治疗后HDL-C浓度降低，但却使黄色瘤或动脉粥样硬化斑块消退[16]，推测普罗布考可能是通过某些有利于HDL中胆固醇转运的机制促成HDL-C的降低。本研究结果提示普罗布考很有可能通过增加FXR表达，促进胆固醇向胆汁酸的转变，这有可能使HDL-C降低，但这一作用有利于胆固醇的排泄，机体抗动脉粥样硬化作用增强。
参 考 文 献

1. Makishima M. Nuclear receptors as targets for drug development: regulation of cholesterol and bile acid metabolism by nuclear receptors [J]. J Pharmacol Sci, 2005, 97: 177-183.
2. Rizzo G, Renga B, Mencarelli A, et al. Role of FXR in regulating bile acid homeostasis and relevance for human diseases [J]. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord, 2005, 5:289-303.
3. Merat S, Malekzadeh R, Sohrabi MR, et al. Probucol in the treatment of nonalcoholic steatohepatitis: double blind randomized controled study [J]. J hepatol, 2003, 38: 414-418.
4. 余艳辉, 瞿湘萍, 李智, 郭兆贵. 兔高脂蛋白血症模型建立及动脉粥样硬化斑块形成的方法学[J]. 中国药理学通报,1998, 14: 473-474.
5. Groen AK, Oude Elferink RP. Lipid transport into bile and role in bile formation [J]. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord, 2005, 5:131-135.
6. Kullak-Ublick GA, Stieger B, Meier PJ. Enterohepatic bile acid salt transporters in normal physiology and liver disease [J]. Gastroenterology, 2004, 126: 322-342.
7. Knight JA. Liver function tests: their role in diagnosis of hepatobiliary disease [J]. J Infus Nurs, 2005, 28: 108-117.
8. Giannini EG, Testa R, Savarino V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians [J]. CMAJ, 2005, 172: 367-379.
9. Fracchia M, Setchell KD, Crosignani A, et al. Bile acid conjugation in early stage cholestatic liver disease before and during treatment with ursodeoxycholic acid [J]. Clinica Chemica Acta, 1996, 248: 175-185.
10. Copaci I, Micu L, Iliescu L, et al. New therapeutical indications of ursodeoxycholic acid [J]. Rom J Gastroenterol, 2005, 14: 259-266.
11. Schwertner HA, Fischer JR. Comparison of various lipid, lipoprotein and bilirubin combina- tions as risk factors for predicting coronary disease [J]. Atherosclerosis, 2000, 1501: 381-387.
12. Ory DS. Nuclear receptor signaling in the control of cholesterol homeostasis: have the orphans found a home [J]? Circ Res, 2004, 95: 660-670.
13. Eloranta JJ, Kullak-Ublick GA. Coordinate transcriptional regulation of bile acid homeostasis and drug metabolism [J]. Arch Biochem Biophys, 2005, 433: 397-412.
14. Redinger RN. The coming of age of our understanding of the enterohepatic circulation of bile salts [J]. Am J Surg, 2003, 185: 168-172.
15. Pieters MN, Schouten D, Bakkeren HF, et al. Selective uptake of cholesteryl esters from apolipoprotein-E-free high density lipoprotein by rat parenchyma cells in vivo is efficiently coupled to bile acid synthesis [J]. J Biochim, 1991, 280:359-365.
16. Tardif JC, Gregoire J, L’Allier PL. Prevention of restenosis with antioxidants:mechanism and implications [J]. Am J Cardiovasc Drugs, 2002, 2: 323-334.