普罗布考对高脂兔脂肪肝形成的影响
赵焕堂 洪绍彩 李奕 农耀明 赵丽霞
（ 武警广西总队医院内科，广西，南宁 530003 ）
摘要 目的 观察普罗布考对高脂兔脂肪肝形成的影响并探讨其可能机制。方法 16只新西兰大白兔给予高脂饲养8周后，随机分为2组：①淀粉组（n =8）：饲以高脂饲料及1%淀粉；②普罗布考组（n =8）：在饲以高脂饮食基础上给予1%普罗布考；另选8只兔为正常饮食组（n =8），给予普通饮食。14周末结束实验。测定血清脂质、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和转氨酶水平，测定肝脏的脂质含量并进行病理学检测。结果 ①高脂饮食8周后总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇的含量明显升高，普罗布考可明显降低上述指标，均为P<0.01；②普罗布考对SOD活性无明显影响，但与淀粉组比较，普罗布考组MDA的含量[(9.2±3.3) μg/ml vs (12.6±4.4) μg/ml, P<0.01]明显降低；③普罗布考组血清转氨酶水平[ALT （45.3±12.9）U/L,AST （49.5±13.0）U/L]较淀粉组[ALT（67.20±14.3）U/L,AST（81.6±21.8）U/L]明显降低，均为P<0.01；④普罗布考干预6周后可明显降低肝脏中胆固醇和甘油三酯的含量，肝脏脂肪病变明显减轻。结论 普罗布考具有降脂、抗氧化和护肝作用，能抑制高脂饮食所致的脂肪肝形成。
关键词普罗布考 脂肪肝 高脂饮食 抗氧化 兔

Effects of probucol on the formation of fatty liver in hypercholesterol-fed rabbits
ZHAO Huan-tang, HONG Shao-cai, LI Yi et al. Department of cardiology, Guangxi Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Nanning 530003.
Abstract Objective To explore the effect of probucol on the formation of fatty liver in high-cholesterol fed rabbits. Methods 16 male New Zealand white rabbits were fed with 1% cholesterol, 7.5% protein, 8% lard diet for 8 weeks, and then were randomly divided into two groups: (1) starch group: maintained cholesterol diet plus 1% starch for 6 weeks; (2) Probucol group: the same cholesterol diet supplemented with 1% probucol for 6 weeks. And control group was fed with normal diet for 14 weeks. We detected the change of serum lipid profile, total activity of superoxide dismutase (SOD), maleic dialdehyde (MDA), alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST) concentrations and the histopathological changes of the liver. Results Compared with control group, rabbits fed with high-cholesterol diet showed higher levels of serum total cholesterol (TC), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and HDL-C, all of which were significantly reduced by probucol. Probucol had no effect on the total activity of SOD, but MDA concentration was significiantly reduced as compared with starch group, (all P<0.05). The AST and ALT levels were dropped significantly at the P<0.05 levels after six weeks
treatment with probucol. The fatty degeneration of liver was ameliorated in probucol group as compared with the starch group (P<0.01). Conclusions Probucol has lipid-lowering and antioxidant properties and appears to be significantly effective in protecting the liver function. Probucol can inhibit the formation of fatty liver in cholesterol-fed rabbits.
作者简介：赵焕堂，男，1964年出生，副主任医师，大学本科，主要从事医疗卫生管理工作。
Key words Probucol fatty liver high-cholesterol diet antioxidant rabbit

高血脂症性脂肪肝(非酒精性脂肪肝的一种)是当今社会的常见病、多发病。随着人们生活水平的提高，脂肪肝患者的人数在逐年增加，对非酒精性脂肪肝目前尚缺乏有效的治疗手段，因此，发展既具有抗高血脂诱发的动脉粥样硬化作用，又有肝脏保护作用的药物具有重要临床意义。普罗布考是1977年在美国上市的降脂、抗氧化药物，具有强大的抗动脉粥样硬化作用，可有效防治经皮冠状动脉成形术后再狭窄[1]。国外的研究结果表明，普罗布考具有良好的降血脂和护肝的双重作用，治疗6个月后可明显降低脂肪肝患者的转氨酶[2, 3]。本研究通过高脂饮食建立兔的脂肪肝模型，观察普罗布考对血脂、肝功能、抗氧化能力以及肝脏病理形态学的影响。
1 材 料 和 方 法
1.1动物和试剂
健康纯种雄性新西兰大白兔购自中南大学湘雅二院医学动物研究中心，清洁级动物，肝组织总胆固醇及甘油三酯、血清超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）和丙二醛（Maleic dialdehyde, MDA）测试试剂盒购自南京建成生物工程研究所。血清脂质和肝功能试剂由日本株式会社提供，其他试剂为国产分析纯。
1.2 脂肪肝兔模型建立和药物干预?
选取24只3月龄、体重(2.5±0.5)Kg的健康雄性纯种新西兰大白兔单笼饲养1周后，记录体重并进行基线血脂、抗氧化能力和肝功能测定。然后给其中16只高脂饮食8周，其余8只进正常粗颗粒饮食（正常饮食组）14周。高脂饮食配方参照Fan JG等报道[4]，具体如下：1%胆固醇、7.5%的蛋黄粉、8%的猪油，余为正常粗颗粒饲料。每只兔每天进食120g高脂饲料，自由饮水。第8周末再次称体重并抽血。第9周开始采用随机分组的方法将高脂饮食兔分为2组，其中普罗布考组（n=8）在高脂饮食基础上给予1%普罗布考，淀粉组（n=8）继续进高脂饲料饮食及1%淀粉。第14周末结束实验。
1.3 检测指标和方法
1.3.1血清生化指标的测定：禁食12h后从兔耳中央动脉抽血约5ml，分离血清，置-70℃冰箱保存。肝功能检测项目包括：谷丙转氨酶（Alanine transaminase, ALT）、谷草转氨酶（Aspartate transaminase, AST）。血脂检测包括总胆固醇（TC）、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）4项。在日本日立公司出产的7600-020全自动生化仪上进行，各指标均采用盲法测定，批间、批内变异系数控制在5.5%和3.5%以内。采用化学底物发色法测定SOD总活性和MDA的含量，严格按说明书操作。
1.3.2 肝脏脂质含量的测定：采用标准的氯仿/甲醇法提取肝脏中的脂质。取同一部位的肝组织2～3g在生理盐水中漂洗以去除淤血，滤纸拭干，准确称取1g湿肝组织，加氯仿/甲醇（2：1，V/V）匀浆，脱脂滤纸过滤后定容在50ml容量瓶，酶法测定总胆固醇和甘油三酯，严格按说明书操作。
1.3.3 肝脏组织切片制备：取肝脏正中叶相同部位的组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，苏木素-伊红（HE）染色，观察肝脏组织形态学改变。脂肪肝的程度参照文献[5]。重度，脂肪变性肝细胞超过肝小叶的2/3；中度，脂肪变性肝细胞约占肝小叶的1/3-2/3；轻度，脂肪变性肝细胞呈散在小灶分布；无，肝小叶结构完好，基本无脂肪变性肝细胞。
1.4 统计学方法：计数资料以均数±标准差（±s）来表示。所有试验数据均输入SPSS10.0统计软件包进行统计分析，对主要指标进行正态性检验，采用配对资料t检验来进行治疗前后不同时间点的比较，采用one-way ANOVA 来进行组间的比较。计量资料间的比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 普罗布考对血脂和脂蛋白的影响
3组兔0周、8周及14周时血脂和体重的变化如表1所示。高脂饮食8周后，TC、HDL-C和LDL-C明显升高，均为P＜0.01。继续高脂饮食至14周时血浆胆固醇水平仍较高，但与8周时比较无显著性差异。普罗布考干预6周后明显降低TC、LDL-C和HDL-C，均为P＜0.01。普罗布考对体重（BW）和甘油三酯水平无明显的影响。
表1 普罗布考对血脂和脂蛋白的影响（±s）

注：与8周时比较 ① P＜0.05, ② P＜0.01; 与淀粉组比较，③ P＜0.05，④ P＜0.01。
2．2 普罗布考对SOD、MDA和转氨酶的影响
高脂饮食8周后，血清SOD总的活性和MDA的含量均明显升高，均为P<0.05。SOD的高水平一直持续至第14周末，但与8周时比较无明显变化，MDA含量则进一步增加。普罗布考对SOD总的活性无明显的影响，但可使MDA的含量明显降低，P＜0.01。高脂饮食8周后，ALT和AST开始升高，第14周末淀粉组ALT和AST明显升高，分别为基础值的1.4和2.1倍。普罗布考干预6周后转氨酶较淀粉组明显下降，基本恢复至基线水平，见表2。
表2 普罗布考对SOD、MDA和转氨酶的影响（±s）

注： 与0周时比较，① P＜0.05, ② P＜0.01; 与淀粉组比较，③P＜0.05，④P＜0.01。
2．3 肝脏的脂质含量测定：
采用氯仿/酚抽提肝脏中的脂质，结果发现正常饮食组肝脏中脂质含量较少。高脂血症性脂肪肝中沉积的脂质以甘油三酯为主，普罗布考干预后肝脏内的胆固醇和甘油三酯含量均较淀粉组明显降低，均为P <0.01，见表3。
表3 三组兔肝组织胆固醇和甘油三酯含量（±s）

注：与正常饮食组比较，①P＜0.05, ② P＜0.01；与淀粉组比较，③P＜0.01。
2．4 肝脏的病理变化：
肉眼见脂肪肝的体积明显增大，含血量减少，呈黄白色，肝脏切面有油腻感。肝脏切片见正常组肝细胞呈条索状排列，核圆规整，而脂肪肝的肝细胞肿大，细胞排列紊乱，充满大小不等的脂肪空泡，空泡大者可将肝细胞核推向一侧，含脂肪的肝细胞可破裂或融合成脂肪囊肿，轻至中度脂肪变性时，脂肪呈向心性分布，重度者可呈小叶周围型分布。轻、中度脂肪变性时并不引起炎症及细胞坏死，但重度脂肪变性时，可伴有轻度局限性炎症和单纯坏死，见图1。

1. 3组兔肝脏脂变程度比较：

正常饮食组仅有1只兔子有轻度的脂肪变性，其余兔肝脏均正常；高脂饮食14周后淀粉组所有的兔子均有不同程度的脂肪肝形成，以中、重度脂肪变性为主，普罗布考干预6周后肝脏脂肪变性的程度明显减轻，主要为轻-中度变性，见表4。

表4 3组兔肝脏脂肪变性程度

　　　　　　　　　　　　　　注：χ2=20.55，P=0.002
3 讨 论
肝脏是脂质代谢的重要场所，在脂肪的消化、吸收、分解、合成和运输中起重要作用。当肝脏对脂肪合成能力增加或/和转运的能力下降时，脂类物质便可在肝内沉积，形成脂肪肝。詹鹰等报道[6]，血脂水平升高者脂肪肝的发生率高达41.6%。目前对于脂肪肝的病理机制尚未阐明，较一致的观点是胰岛素抵抗的一次打击（first hit）和脂质过氧化的第二次打击（second hit）学说[7]。普罗布考是脂溶性的调脂兼抗氧化药，具有明显的抗动脉粥样硬化作用。Korkusuz等[8]通过电镜观察了高脂饮食兔肝细胞结构的改变，结果发现普罗布考通过影响滑面内质网和线粒体而发挥解毒作用。本研究发现高脂饮食8周后，血清TC和LDL-C明显升高，至14周时所有兔子均有不同程度的脂肪肝形成。普罗布考治疗6周后血清TC、HDL-C、LDL-C和转氨酶水平明显降低，提示普罗布考在降脂的同时具有护肝作用，与国外的临床研究结果一致[2, 3]。普罗布考干预后肝脏脂肪变的程度明显减轻，与Yashida等研究结果一致[9]，证明普罗布考具有防治高脂饮食引起的脂肪肝形成的能力。
本研究结果显示高脂饮食8周后SOD的活性和MDA的含量均明显增加，提示随着血脂水平的升高，机体的抗氧化能力也进一步增强。普罗布考干预6周后，虽然血清总SOD活力没有明显的改变，但脂质过氧化产物MDA含量却明显降低，提示普罗布考具有明显的抗氧化能力，能抑制脂质过氧化产物的形成。脂肪肝发展为肝硬化的最后的步骤是肝细胞的氧化损伤[2]，本研究结果显示普罗布考组肝脏内胆固醇和甘油三酯的含量均较淀粉组低，提示普罗布考可减少肝脏内脂质的沉积，其降脂作用并非是影响体内脂质的再分布，普罗布考的护肝作用可能与其抗氧化作用有关。
普罗布考防治脂肪肝形成的原因可能与以下因素有关：（1）降脂作用。普罗布考可通过降低胆固醇的合成和促进胆固醇的分解两条途径降低血清胆固醇的浓度[10]，同时本研究及既往的研究均表明普罗布考可抑制肝脏的脂质合成，减少了内源性脂质的产生[11]，从根本上断绝了脂质沉积的来源。（2）普罗布考的抗氧化作用。脂质沉积的第一步是低密度脂蛋白的氧化，普罗布考具有抗氧化作用，可抑制氧化型低密度脂蛋白形成的作用[12]，防止肝细胞的氧化损伤。（3）普罗布考促进胆汁酸的合成，使胆固醇从胆汁酸的排泄增加[13]，促进胆固醇的逆转运。
由于很多高血脂性脂肪肝患者伴随着转氨酶的升高，而目前大多数调血脂药如他汀类药物对肝脏有不同程度的损害。普罗布考没有明显的肝损作用，相反却可以在降低血脂的同时降低脂肪肝所引起的转氨酶升高，阻止脂肪肝的进一步发展，为脂肪肝患者提供了新的选择。
4 参 考 文 献

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