B100缺陷症
家族性载脂蛋白B100缺陷症(familial defective apolipoprotein B100, FDB)于1986年首次发现。在研究血浆胆固醇水平中等度升高的人群时, Vega等注意到少数受试者的低密度脂蛋白(LDL)在体内分解代谢速率缓慢, 而其LDL受体功能正常, 推测可能是因LDL颗粒自身的异常所致。正常血浆脂蛋白的分解代谢主要受其所含载脂蛋白的影响, 由于LDL中的载脂蛋白(apolipoprotein, Apo)95%以上是Apo B100, 因而认为可能是因Apo B100的遗传性缺陷所致LDL与其受体结合障碍, 由此而影响LDL在体内的分解代谢速率。随后的研究证实了这一推论。现已确认是由于Apo B100中3500位上的精氨酸(Arg)被谷酰胺(Gln)所置换(Arg3500→Gln), 造成含有这种缺陷Apo B100的LDL与受体结合障碍。由于Apo B100分子中其他部位的氨基酸也可发生置换而影响Apo B100与LDL受体结合的功能, 所以, 有人建议采用FDB3500这一术语来描述Vega等人发现的家族性载蛋白B100缺陷症。后来Pullinger等发现一例FDB患者, 其缺陷是在Apo B100的3531位上的氨基酸被置换, 因而称为FDB3531。此外, Gaffeny等发现一例FDB3500患者, 其3500位上在氨基酸不是被GLn置换, 而是被色氨酸置。因此, 有人建议采用FDB3500Q来表示早期发现的FDB, 而对新近发现的病例采用FDB3500W。虽然, FDB和家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia, FH)都是由于LDL分解代谢障碍而引起的高胆固醇血症, 然而两者所致高胆固醇血症的病理生理机制不同。FDB是因Apo B遗传缺陷即配体的缺陷所致, 而FH则是LDL受体的遗传缺陷所致。
第一节 发现过程
为了寻找原发性胆固醇血症的病因, 有人对15例血浆胆固醇浓度中等度升高者进行初步研究。将受试者和正常对照者的LDL进行放射性标记后, 静脉注射入受试者体内, 观察两种LDL在体内的消失情况。发现其中10例受试者的LDL与正常的LDL在体内清除基本相同, 而另5例受试者自身的LDL在体内清除率较正常LDL缓慢, 其中1例LDL清除速率仅为正常的50%。由于正常情况下, 2/3或3/4 的LDL是经由肝脏内LDL受体途径清除, 故推测这5例受试者的LDL与肝内LDL受体亲和力差。体外试验进一步发现, 这些LDL与人成纤维细胞膜上LDL受体的亲和力仅为正常LDL的32%。这样, 体内代谢观察与体外试验结果是一致的, 均提示受试者的LDL与其受体结合存在障碍。
对于这种具有受体结合障碍的LDL进行结构分析, 并没有发现这种LDL的脂质结构与正常LDL之间有明显不同。应用电镜或梯度凝胶电泳法检查也没有这种LDL的颗粒大小和形状有任何异常。进行密度梯度超速离心分离这种LDL, 亦无异常发现。此外, 对于完整的Apo B100进行初步研究, 也没有发现包含在这种LDL的Apo B100有任何重要的片段缺失或插入。
基于上述研究结果, 可以认为这类患者的LDL结果基本上是正常的, 仅有与受体结合障碍。推测可能是Apo B100发生微小或单个氨基酸突变, 而这种突变应该是位于或接近于其受体结合的结构域。采用四个Apo B100特异单克隆抗体, 以探查完整Apo B100的突变部位。发现其中一种单克隆抗体(MB47)可使患者的LDL与受体亲和力增加。这一现象提示Apo B100的突变部位是位于MB47抗原决定簇部位。而MB47的抗原决定簇则是Apo B100中3442-3569位氨基酸残基,因而突变很可能是位于3490-3510位氨基酸残基附近。
为了进一步确定引起受体结合障碍的突变部位, 对Apo B100基因核苷酸7500-11916进行序列分析。该核苷酸区域编码出Apo B100中2488至3901位氨基酸, 这包括了Apo B100的受体结合结构域。研究结果仅发现Apo B100基因中, 第26个外显子上10708位核苷酸突变(G→A), 即编码Apo B100的3500位氨基酸的核苷酸CGG突变为CAG, 因而造成Apo B100的3500位上精氨酸被谷酰胺置换。随后, 用PCR与等位-特异寡核苷酸探针方法, 可迅速可靠地发现Apo B100第3500位上的位点突变。新发现的FDB者均有相同的Apo B100 DNA突变以及与受体结合能力降低。对FDB患者进行家族调查,发现FDB呈常染色体显性遗传, 所有FDB均为杂合子。最近, 有人报道了1例纯合子FBD。
从理论上讲, Apo B100结合域中其他部位的氨基酸置换也可能引起LDL的分解代谢障碍。不过至今所报道的FDB几乎都是发生在3500位氨基酸的突变, 仅有一例报道apo B100突变发生在3531位氨基酸, 也是精氨酸被谷酰胺置换。体外试验证实含有这种突变Apo B100的LDL, 与人成纤维细胞膜上LDL受体的亲和力也较正常LDL明显低下。
虽然, 早期对FDB的检测是采用等位-特异寡核酸探针进行印迹杂交, 该法能准确地探测出Apo B100突变的等位基因。但是, 由于该方法较为费时, 需要应用32I标记的探针, 故不适合于大规模的研究或在人群中进行常规规普查。有必要建立更为简便的方法。虽然Apo B100(Arg3500→Gln)突变并没有引起或破坏限制性内切酶的识别部位, 但通过改变单个硷基, 则可在PCR产物中引起断裂位点。其优点是无需使用有放射性的物质。不过这种方法仍然需要进行酶消化, 并要使用聚丙酰胺电泳法分离PCR产物。
最近, 有人联合应用不对称性PCR和等位特异PCR, 并用三个寡核苷酸引物, 用于检测Apo B100(Arg3500→Gln)突变。该方法用于大样本调查是很有希望的, 因为该法不需要进行限制性内切酶消化步骤, 亦不需要与有放射活性的探针进行杂交。 此外, 一些实验室已开始采用混合样本法(a pooling strategy), 筛选大系列样本中Apo B100(Arg→Gln)突变。此法若与快速DNA提取程序以及单次PCR反应同时应用, 对于直接检测FDB突变位点, 具有经济、高效和实用的优点。
新近有人介绍一种简便的U935细胞方法用于FBD的检测, 由于U935细胞的增殖受其培养液中LDL浓度的影响, 而U935细胞不能有效地摄取FDB血浆中的LDL, 因而增殖明显减慢, 通过细胞计数则可区别其培养液中是含FDB的LDL或正常的LDL。