第二节 脂蛋白分离和定量测定
已有许多方法能将血浆脂蛋白分离成多种不同的种类。临床实验室中常用的技术有沉淀法、电泳法和超速离心法(彩图35)。
一、沉淀法
由于载脂蛋白(Apo)B与一系列沉淀因子之间有特殊作用, 通过沉淀法能将含Apo B的脂蛋白与不含Apo B的脂蛋白分离。因此极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)能与HDL分离。有数种沉淀法可供选用, 但两种方法最为常用, 即肝素/锰法和镁/磷钨酸法。
(一)、 样本准备
沉淀法多采用血清样本。如果使用血浆样本, 且采用肝素/锰沉淀法分析时, 则锰的用量需要增加一倍。这可造成上清液中锰的含量过高,继而影响该上清液中胆固醇的酶法测定。对于血浆甘油三酯(TG)浓度大于4.5mmol/L(400mg/dl)的样本, 在采用沉淀法(特别是采用肝素/锰法)分析前, 必须进行预处理, 以清除VLDL和糜乳微粒。若不进行预处理将会导致不完全沉淀, 造成HDL-C测定不准确。可采用超速离心(以100000g速度离心18小时)或超滤法加以清除。一般不主张采用稀释样本的做法。
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方案1. 用镁/磷钨酸沉淀法进行HDL-C定量测定
试剂: (a) 0.5M二氯化镁(MgCl2)
(b) 4%磷钨酸溶于0.19M氢氧化钠(NaOH)液中
步骤: (1) 在两份各0.5ml新鲜血清中分别加入50ul MgCl2(a)和50ul磷钨酸液(b)。
(2) 充分混匀并立即以2000g速度离心20分种。
(3) 取出上清液进行HDL-C测定, 在测定前上清液可冰冻保存。
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方案2. 用肝素/锰沉淀法进行HDL-C定量测定
试剂: (a) 2000u/ml肝素(冻干猪肠粘液肝素)
(b) 0.55M MnCl2(如用含依地酸二钠血浆时, 则需用1.1M MnCl2)
步骤: (1) 将0.5ml两份新配血清预冷到4℃,然后分别加入50ul肝素(a)和 50ul MnCl2液(b)。
(2) 充分混匀后放在4℃下静置45分钟。
(3) 在相同的温度下(4℃)以1600g速度离心30分钟, 取出上清液进行HDL-C测定, 测定前上清液可冷冻保存。
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用酶法测定经肝素/锰沉淀法所获的上清液中胆固醇时, 很重要的一步是应在反应混合液中加入依地酸二钠(EDTA), 以防止棕色沉淀产生, 否则将会造成HDL-C浓度人为的升高。
(二)、方法的选择
肝素/锰沉淀法是"脂质调查临床流行病学计划研究"所采用的方法, 并为"临床生化国际联合会"所推荐的方法。采用这种方法所获得的结果与超速离心法所获的结果很接近。镁/磷钨酸测定法的优点是方法较为简便, 无机试剂易于获得且易保存, 不需静置一段时间或冷却离心, 很少因富含TG脂蛋白的浓度过高而影响结果,同时对采用酶法测定胆固醇也无影响。而采用肝素/锰沉淀法分析HDL-C时, 若血浆甘油三酯浓度过高, 则需先进行超速离心以分离VLDL, 然后再进行沉淀, 所以较为繁锁。
采用镁/磷酸沉淀法测定HDL-C尚存在有待解决的问题是, 该法所测得的HDL-C浓度偏低, 通常低10%左右, 这可能与该法能有效地使部分位于HDL密度范围内的含Apo B脂蛋白及脂蛋白(a)[Lp(a)]沉淀有关, 也可能与其使部分含Apo AI的脂蛋白沉淀有一定的关系。多数商业药盒为镁/磷钨酸试剂, 而实验室常采用肝素/锰沉淀法所提供的参考范围。假如用镁/磷钨酸沉淀法测定, 血浆HDL-C<0.8mmol/L(31mg/dl)可视为低HDL-C血症, 而通常的低HDL-C血症的标准是HDL-C<0.9mmol/L(35mg/dl)。流行病学研究发现, 血浆HDL-C水平低下是冠心病的危险因素之一, 用肝素/锰沉淀法测定的HDL-C结果较采用镁/磷钨酸沉淀法所获结果具有更强的预测性。
(三)、Friedewald公式 当血清甘油三酯浓度低于4.5mmol/L(400mg/dl)时,VLDL中胆固醇的含量与血清甘油三酯浓度完全呈常数线性关系。可根据已知HDL-C浓度和血清总胆固醇(TC)以及TG浓度计算出LDL-C浓度: LDL-C(mmol/L)=TC-(HDL-C+TG/2.2*)(注: *假如所采用单位为mg/dL, 则常数为5), 这就是Friedewald公式。这对没有超速离心条件时或因调查研究的规模较大限制了采用超速离心费用时特别适用。有人建议采用甘油三酯所除系数为6(以mg/dl为单位时)而不是5, 以使其结果更为准确, 但最近的研究结果并不支持这一观点。纵观其他有关评估结果, 已发现此公式令人惊奇地接受了时间的检验。应用该公式计算所得的LDL-C浓度的变异系数为7.3%, 与直接法测定LDL-C值变异系数(6.8%)相当。应当强调的是, 此公式并不适用于非禁食状况下所获得的血样本或III型高脂蛋白血症患者。
(四)、HDL亚组分的定量测定
尽管近年来将HDL分为HDL2和HDL3两个亚组分已引起人们广泛关注, 但尚末研究出一种实验方法能使各实验结果相近。甚至还未制定出一个参考标准。因此, 文献报道中血清或血浆HDL2和HDL3的相对浓度差异很大。测定值的变化范围从两者大致相等到HDL2低于HDL3的1/4。这些测定值的差别大都与方法有关。制备性超速离心易于产生相对高的HDL2水平。在速率区带超速离心和分析性超速离心基础上所测定的值更易出现偏差且变化较大, 但他们一般都使HDL2相对浓度倾向偏高。相反, 联用肝素/锰和硫酸葡聚糖或聚乙烯二醇作双重沉淀分析使HDL2水平偏低。用肝素/锰法的上清液(密度为1.125g/mL)作超速离心所得出的HDL2结果最低。经验表明,与正常人相比, 糖尿病或肾病综合征等患者的血清(或血浆)用制备性超速离心和双重沉淀法测得的HDL2水平差异更大, 可能是由HDL的物理性质及Lp(a)的浓度发生了改变。关于HDL亚组分分离的详细方法将在以后介绍。
二、电泳法
(一)、纸上和琼脂凝胶电泳
在早期对高脂蛋白血症进行分类时, 多采用血浆纸上电泳及后来发展的琼脂凝胶电泳, 这两种方法都只是半定量测定法。他们可将血浆脂蛋白分离为α(HDL)、β(LDL)和前β(VLDL)脂蛋白带, 乳糜微粒则滞留在原位。在分析某些异常的高脂蛋白血症时这两种方法仍有价值。如在分析III型高脂蛋白血症时, 有人仍主张用这些方法作为筛选方法。但此种宽的β带也常见于IIb或V型高脂蛋白血症, 因此在考虑为III型高脂蛋白血症时, 最好测定Apo E表型或基因型, 或采用超速离心法进一步分析。
(二)、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳(PAGE)
1. 一般注意事项
梯度凝胶电泳根据脂蛋白颗粒大小将其分离, 脂蛋白通过浓度呈梯度增高的聚丙烯酰胺在电埸中移动, 随着聚丙烯酰胺浓度的增加, 基质中孔径逐渐变小, 这就使原已按其颗粒大小分开的带电荷的脂蛋白发生不同程度的移动滞缓。当达到其分离极限时, 颗粒的移动最终停止。PAGE已广泛用于不同种类的载脂蛋白分离和载脂蛋白的多态性分析。
2. 方法学的注意事项
a. 凝胶 聚丙烯酰胺梯度范围取决于分离的脂蛋白颗粒类型。一般而言, 4-30%的梯度凝胶能有效地分离HDL, 而2-16%的梯度凝胶能分离LDL, IDL和VLDL。应注意VLDL的穿透性是有限的, 一般只有小于40nm直径的脂蛋白颗粒才能通过。梯度凝胶可从很多公司定购(如Flowgen, Bio-Rad公司)。
b. 样本准备 梯度凝胶电泳可直接分析血浆样本或超速离心分离出的脂蛋白样本。但因其分离有赖于分子的大小, 在准备样本时必须采取一些措施以保证颗粒的完整性。其中包括在血浆中加入一些试剂以防止: (1)氧化修饰(加入终末浓度为0.4%的EDTA, 并在氮气中贮存); (2)脂蛋白变性(加10mM 5.5-二巯基2-硝基苯并酸,以抑制卵磷脂胆固醇酰基转移酶的活性); (3)蛋白酶降解(加入0.015%苯甲基氟磺酰, PMSF); (4)细菌性破坏(加入0.05%偶氮化钠)。同时要避免长时间贮存。梯度凝胶电泳所用血样本不宜冰冻。在电泳前, 超速离心分离出的脂蛋白样本中的高浓度盐类应进行透析处理使之降低。
c. 电泳 将凝胶加入垂直式制胶夹板, 在10℃电泳缓冲液中(90mM缓血酸胺基质, 80mM硼酸, 3mM EDTA, pH8.3)以125V电压将凝胶预处理20分钟。用含4%庶糖和0.05%溴酚兰溶液稀释标本(4:1体积比), 将相当于10-15ug蛋白的脂蛋白样品溶液加入凝胶器中, 电泳时在凝胶中依次通入15V电压25分钟, 70V电压20分钟和125V电压24 小时, 总共相当3000V.小时电流。
d. 染色 所用染料类型依测定样本而定,蛋白质染色适应于已分离的脂蛋白样本, 但当血浆样本电泳时, 大量的血浆蛋白掩盖脂蛋白区带, 此时必须使用脂质染色。
蛋白质染色: 将凝胶放入含0.05%Coomassie蓝R-250的甲醇:醋酸:水(50:10:40体积比)混合液中进行染色, 然后在不同比例的甲醇:醋酸:水(20:9:7体积比)混合液中进行脱色处理, 直到底色变清。
脂质染色: 普通脂质染色的方法有多种, 但最常用的是红油-O法, 用含0.04%红油-O的60%甲醇液, 在55-60℃温度下进行凝胶染色至少24小时, 然后在5%醋酸中脱色。
e. 测定颗粒大小
凝胶可用含已知水合直径的蛋白质混合物(见表6-1)样本进行标准化, 混合物中每种蛋白质含量为2.5ug, 比较标准蛋白质和脂蛋白的移动距离, 即可计算出脂蛋白颗粒的直径。
表3-37-1. 聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳的标准蛋白质直径
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蛋白质 水合直径(nm) 非水合直径(nm)
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甲状腺球蛋白 17.0 11.6
铁蛋白 12.2 10.2
过氧化氢酶 10.4 8.2
乳酸脱氢酶 8.1 6.9
牛血清白蛋白 7.1 5.4
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f.密度测定法: 用商业化标准仪器(Pharmacia, Bio-Rad)进行着色凝胶的密度测定。Cooomassie蓝R-250染色的凝胶用555nm波长测定其密度; 红油-O染色则用530nm波长测定; 脂质染色凝胶的蛋白密度用280nm波度测度。比较脂蛋白和标准蛋白质的密度峰值面积可计算出每种脂蛋白的含量。带电脑的密度测定仪对脂蛋白量和颗粒大小的计算很有帮助。
g. 测定的其他方法: 通过Western印迹法,可使脂蛋白电泳转移到硝酸纤维素薄膜上(详见后述)。一般说来, 脂蛋白的转移不如蛋白质容易, 但在印迹缓冲液中加入去垢剂可增加转移, 因其促进载脂蛋白从脂蛋白中释放出来。然后, 用特异抗体识别转移到硝酸纤维素薄膜上相应的载脂蛋白, 而脂蛋白的位置可由其特异的载脂蛋白成分来鉴别。
(三)、等电聚焦(Isoelectric focusing, IEF)
等电聚焦的方法可将脂蛋白按其等电点不同而分开。聚丙烯酰胺或琼脂凝胶都可采用。目前脂蛋白的等电聚焦还没有用于临床, 但这种方法在分离载脂蛋白和测定其多态性方面很有价值。最有临床意义的是鉴别Apo E的异构体(Apo E2、E3和E4)这可对Apo E进行表型分类, 它有助于诊断III型高脂蛋白血症。同时也可以检出Apo CII, 这对研究重症高甘油三酯血症有较大的帮助。
三、制备性超速离心法
脂蛋白的水合密度较其他血浆蛋白低, 可通过漂浮超速离心将其从血浆中分离出来。这种方法可用于制备大量有待进一步分析的脂蛋白样本或少量临床研究的样本, 加入NaCl和/或KBr后, 血浆密度增加, 在超速离心过程中各类脂蛋白因其密度不同而上浮速率各异。每类脂蛋白可通过依次增加血浆密度而分离。超速离心一般需较长时间, 有证据显示在超速离心时各类脂蛋白之间出现脂质与载脂蛋白相互交换, 此乃本项技术的主要缺点。但目前脂蛋白分类的标准是按其水合密度而定, 因此超速离心仍然是多数研究所采用的方法。用于脂蛋白分析的三种常见的超速离心法是: 分析性超速离心、区带超速离心和制备性超速离心(采用固角转子或甩平头转子)。
超速离心过程中, 为防止脂蛋白发生变性, 样本应按电泳方法节所介绍的一些技术进行处理。可在新鲜血浆样本中加入EDTA(0.04%终未浓度)、偶氮化钠(NaN2 0.05%)和苯甲基氟磺酰(PMSF 0.015%)防止脂蛋白变性。
(一)、用固定角头序贯漂浮超速离心分离脂蛋白
这种方法对于制备实验所用或进行成份分析时的脂蛋白样本很有价值。脂蛋白的回收率可能较低, 因此要求操作者有熟练的技术以保证脂蛋白浓度结果精确性。
离心转头和离心时间的选择
用于脂蛋白分离的离心机有多种, 具体选择主要取决于超速离心的类型和分析样本的数量和体积。固定角头能将脂蛋白运行的路线缩短到最小程度。60Ti和42.1Ti Beckman转头是采用此项原理的实例。临床上测定脂蛋白浓度的常用方法在方案3和方案4中描述。方案3介绍实验研究采用的脂蛋白分离方法, 方案4和方案5介绍临床运用的脂蛋白浓度测定方法。
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方案3: VLDL, IDL, LDL和HDL分离的方法
(1). 按样本制备的要求(见前述)处理250ml血浆。
(2). 将血浆分置于聚碳酸酯厚壁离心管(38.5ml), 然后盖上, 用0.5M NaCl平衡。
(3). 在10-15℃下以30000r.p.m(100000g) 转速离心20小时。乳糜微粒和VLDL浮于离心管上层, 而其他血浆蛋白和脂蛋白沉于管底并形成含脂蛋白和其他蛋白的沉块。如需将乳糜微粒单独清除, 在20小时连续离心前将血浆以20000r.p.m 转速离心30分钟即可。
(4). 用巴斯德(Pasteur)吸管将VLDL层和其部分透明的非脂蛋白层吸出。假如需要高纯度的VLDL, 可将收集的上层清液在相同条件下再次离心。如要确保无VLDL或乳糜微粒混杂, 也可将下层液再次离心一次。应注意在重复超速离心时某些脂蛋白成份(特别是Apo CIII)可能会丢失。
(5). 将下层液中的小沉块搅散并混匀, 测定其溶量。
(6). 通过以下两种方法可提高下层液中的密度。
a. 加固态KBr: 此法的优点是只使超速离心的样本体积轻微增加。但并不十分完美。考虑到原子体积与浓度和温度相关, 故KBr的量必须根据具体情况计算。
b. 另一种目前较常用的方法是在样本中加入"重液"。 将153 g NaCl、354g KBr和100ug EDTA溶于1升水中配成密度为1.33g/ml的溶液即为"重液"。因其中有些溶质在贮存中易于结晶, 所以这种溶液要定期在10-15℃条件下仔细校对其密度。
(7). 如需要进一步分离IDL, 在下层液中加入足量的高密度液使其密度达到1.019g/ml。高密度液的需要量可按下列公式计算:
D-D1
V2 = V1 x ───
D2-D
V1=溶液的初始体积; V2=需要加入的高密度液的体积; D=要求达到的密度;D1=初始密度; D2=高密度液的密度。(0.15M生理盐水和血浆的密度大约为1.006g/ml)。
(8). 混匀后将上述1.019g/ml密度的溶液置入离心管内。此时需要用密度1.019g/ml的贮存液将其平衡。一系列不同密度的贮存液(如1.019, 1.063, 1.125, 1.21g/ml)可用不同量的高密度液加入0.15M生理盐水制备。
(9). 在10-15℃下以30000r.r.m速度离心24小时, 将含IDL的少量上层液吸出, 用适量高密度液与剩余的下层液混合; 使其密度达到1.063g/ml。
(10). 将上述液体加入离心管, 并用密度1.063g/ml的贮存液平衡, 在10-15℃下以30000r.p.m速度离心28小时。
(11). 上层少量LDL液吸出后, 将收集的下层液的密度调至1.21g/ml, 然后在10-25℃下以30000r.p.m速度离心48小时使HDL上浮。再将小量HDL液吸出。该方法亦可用于分离单种脂蛋白成份。以下两过程可同时进行以节省时间。例如, 可通过使血浆密度升至1.21g/ml后离心48小时即可把全部血浆脂蛋白成份分开。
(12). 如分离出的脂蛋白样本要用凝胶电泳技术进一步分析研究, 可先用低盐缓冲液(如pH8.0, 0.4%EDTA, 0.05%偶氮化钠, 10mM盐酸-三羟基甲基氨基甲烷液)在4℃下透析12小时, 将其中高浓度盐清除。有时HDL也应在贮存前进行透析处理。但应注意到这种方法制备的脂蛋白样本含有少量的白蛋白, 如有必要, 可用原始样本制备的条件将分离出的脂蛋白再行超速离心, 以清除其中的白蛋白。
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(二)、用固定角头进行脂蛋白的定量分析
前面描述的方法适用于分离大量实验所用或供分析用的脂蛋白样本, 但其回收率很低, 当临床上需要测定脂蛋白的浓度时, 可采用另一种回收率较高、所用的样本量较少的方法。可选用50.3Ti Beckman转头, 并用配备18x6.5ml一次性使用的同质异晶聚合物管。
通常需要用超速离心法清除密度小于1.006g/ml的脂蛋白(乳糜微粒和VLDL), 以利于沉淀法测定HDL-C。III型高脂蛋白血症的诊断常常需测定密度低于1.006g脂蛋白样本中胆固醇浓度。
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方案4: 超速离心法定量测定VLDL-C
(1). 将5ml血浆置入6.5ml的超速离心管中, 然后加入1ml 0.15M NaCl溶液。
(2). 离心前另加几滴NaCl溶液进行平衡, 然后以100000g(40000r.p.m, 50.3Ti转子)转速在10-15℃下离心18小时, 这样可将富含甘油三酯的脂蛋白与IDL、LDL和HDL充分分离。前者浮于上层清液中, 后者含于下层液中。
(3). 上层清液通过吸管移液法吸出, 最好用管切法切割。然后放入5ml容积的容瓶中, 进行脂质测定前往瓶中加入0.15M缓冲盐水至5ml。
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方案5: 超速离心法定量分析HDL-C
(1). 假如要用超速离心法测定HDL-C, 取3ml血浆加入至6.5ml超速离心管中; 然后经计算加入一定量的"重液", 形成密度为1.063g/ml的混合液, 所需"重液"的体积通常为2ml。
(2). 将超速离心管转动使其中溶液混合, 然后再加入1ml密度为1.063g/ml的溶液。
(3). 用数滴密度为1.063g/ml的溶液进行平衡处理, 然后在20℃下以40000r.p.m速度离心48小时。
(4). 用吸管移液法(管切法更好)将上层清液(为VLDL、IDL、LDL)移出, 然后将下层液置入5 ml容积的量瓶中, 加0.15M缓冲生理盐水至5ml。由此测出的HDL-C浓度很精确且适用于大多数情况。HDL可用1.21g/ml密度漂浮超速离心分离, 但此法需进一步校准体积和超速离心。并在相当程度上降低了回收率和结果的准确性。
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定量分析VLDL-C和HDL-C时, 常用双管法, 这能克服序贯漂浮法的复杂性和不准确性。其中一支试管为密度<1.006g/ml的样本。在禁食状态下主要是分离出VLDL。另一支试管则为分离HDL用的样本。这能分离出含HDL的下层液和含VLDL和LDL的上层清液。此管上层清液还要进行胆固醇测定。根据已知血清总胆固醇量, 按差值和回至收率(常>96%)可推算出LDL-C量。
此方法有时会很复杂, 例如当测定HDL3-C时, 需要用第三支试管以1.125g/ml的密度超速离心, 要达到此目的, 应将2ml血浆加入到一支6.5ml容积的试管中, 然后经计算加入一定量的"重液"(常为3ml)使其密度为1.125g/ml, 混合后再加1ml密度1.125g/ml的溶液, 并用几滴相同溶液平衡。 在以40000r.p.m速度离心48小时后, HDL3位于下层液中。密度较低的脂蛋白上浮于透明的上层清液中。
(三)、密度梯度超速离心
近年来, 用甩平头(水平式转头)进行密度梯度超速离心以分离脂蛋白的方法越来越普及。分离脂蛋白时, 此法与序贯超速离心比较, 其主要的优点是能大大缩短离心时间。而缺点在于, 它所能处理的血浆样本量较序贯超速离心法少得多。因此, 尽管此方法是脂蛋白分离的有效手段, 但不能作为制备大量脂蛋白样本的方法。然而当临床研究需要了解各类脂蛋白的组成情况时, 密度梯度超速离心因其快速而广泛采用。
密度梯度离心方法是先将血浆的密度增高(直接加入固态NaBr或KBr), 并放入试管底部, 然后在其上面依次加入密度递减的溶液。用水平式转子超速离心时, 脂蛋白颗粒按密度梯度上浮分布。有两种密度梯法可供选用: 一种是连续梯度法; 另是一种是非连续梯度法。连续密度梯度超速离心时, 脂蛋白颗粒按其密度大小浮于其密度阶梯的特定部位。超速离心后, 用市售的梯度分镏器或在离心管底部钻孔将梯度溶液分馏并收集分馏液。这两种技术都要花费时间和精力, 因为这种梯度溶液易被搅混, 如当离心管从水平位回到垂直位时, 可引起脂蛋白分布的混乱。为克服梯度溶液分馏的困难; 现多采用非连续梯度离心法。
1. 非连续密度梯度超速离心法
非连续密度梯度由分层加入的密度递减溶液组成。这可使不同密度的脂蛋白成分依次浮于梯度的上层而分离。在此介绍的方法(以Lidgren等的方法为基础)适用于Bechman SW40Ti甩平头与Beckman LM-8超速离心机。如用其他类型的转头和离心机时, 应重新计算适当的离心时间。用于SW40Ti转子的离心管有很多厂家生产。 当选择离心管时, 保证其"亲水性"致关重要。这样在离心管的内表面可形成均匀的液流以便于梯度形成。用Holmquist法(1982)进行聚乙烯醇涂层的非亲水性离心管也能形成这种均匀的液流。
所需溶液: 需要两种密度的贮存液:
a. d=1.006g/ml溶液: 22.4g NaCl; 0.2g EDTA和2ml 1M的NaOH溶于2升蒸馏水中。
b. d=1.182g/ml 溶液: 在1升d=1.006g/ml的溶液中加入24g NaBr。
然后将两种溶液接不同比例(见表6-2)混合即可配成6 种非连续性梯度溶液。
表6-2. 非连续性密度梯度溶液制备
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溶液 密度(g/ml) a液(1.006g/ml) b液(1.182g/ml)
(ml) (ml)
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1 1.0988 75 83.67
2 1.0860 75 62.49
3 1.0790 75 53.16
4 1.0722 75 45.15
5 1.0641 75 39.93
6 1.0588 75 32.19
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样本准备: 于2ml新鲜血浆样本中加固体NaCl配成密度1.119g/ml的液体。一般需要0.341g NaCl。但在明显高脂血症的样本中需要加入NaCl0.35g。轻摇混合30分钟。
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方案6: 用非连续密度梯度超速离心分离脂蛋白
(1). 准确吸取0.5ml密度为1.182g/ml的溶液置入离心管, 然后在其上加入2ml血浆样本。
(2). 在血浆样本上依次加上表6-2中的6种梯度溶液(从第一种溶液开始)以形成非连续梯度。加入每种溶液的量见表6-3。在加入各种溶液时最关建的一点是必须非常小心以防止各溶液的相互混合。一般用吸管移液法让溶液缓慢沿离心管内侧(倾斜45℃)流入即可避免混合。
(3). 在23℃下以39000r.p.m速度离心1 小时以分离漂浮率(SF)为60-400的脂蛋白。不用制动器让转子自动停转。让离心管留在转桶内。用微量吸管从离心管上部吸取1ml SF>60的脂蛋白, 并移入到1ml 体积的容量管中。样本吸出后, 在离心管梯度上部缓慢加入1ml密度1.0588g/ml的溶液, 然后再将转桶和转子放回离心机。
表6-3. 非连续梯度的制备
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溶液 密度 所加入的量*(ml)
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1 1.0988 1
2 1.0860 1
3 1.0790 2
4 1.0722 2
5 1.0641 2
6 1.0588 2
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*包括血浆在内的总体积=12.5ml。
(4). 以18500r.p.m速度离心15小时41分钟, 离心后吸出梯度上层的0.5ml溶液(含SF20-60的脂蛋白), 将转桶及转头复位。
(5). 以39000r.p.m速度离心2小时35分钟, 从梯度上层吸出0.5ml溶液(含SF12-20的脂蛋白)。再将转桶及转子放回离心机。
(6). 以30000r.p.m速度离心21小时20分钟, 从梯度上部吸出1ml液体, 至此整个离心过程完成。
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(四)、单旋垂直头密度梯度超速离心
新近发展起来的一种替代经典密度梯度超速离心的方法是用垂直转头进行单旋密度梯度超速离心。这种方法也需要在调整血浆样本密度基础上建立一个溶液的梯度。在垂直转子内进行离心。这种方法的优点在于快速。据离心机类型不同, 可在25-30分钟内完成脂蛋白分离。脂蛋白按其密度上浮到密度的相应部位。离心后每级梯度可用梯度分馏器从离心管中移出。这种方法学的主要缺点是VLDL和白蛋白易于附壁, 或引起高达40%的VLDL丢失。用此方法时每个转头内所需血浆比序贯漂浮法少, 可根据需要而选择。