第三节? 血浆

第三节血浆、脂蛋白-胆固醇及甘油三酯的测定

很多方法可用于测定血浆胆固醇和甘油三酯及脂蛋白成份。其中包括化学方法和以高效液相色谱分析及液-气色谱分析法为基础的方法。然而这些方法一般很费时, 并需用毒性化学物质, 需要很长的提取和清除过程。对临床实验室而言, 以酶学技术为基础的分析方法可能更适用。他们简单易行, 快速准确。易于自动化分析, 多个厂家可生产所需的成套药盒。酶学法测定分析胆固醇和甘油三酯的原理是:通过特殊氧化酶使底物生成过氧化氢, 然后经过氧化酶使他们结合成色原(生色团)。因生色原生成量可用比色法进行测定, 所以产生的颜色与分析物的量成比例。据此先绘出已知分析物量的标准曲线, 然后进行待测分析物的测定。

以下是胆固醇测定的典型反应顺序:

胆固醇酯酶

胆固醇酯+H2O──────→胆固醇+脂肪酸

胆固醇氧化酶

胆固醇+O2──────→ 4-1烯胆固醇+H2O2

过氧化酶

H2O2+4-氨基比林+酚(碳酸)─────→亚胺醌+H2O

亚胺醌染料[4-(P-苯醌-单亚胺)安替比林]可在500nm波长下进行测定, 游离胆固醇的测定可省去胆固醇酯这一步。游离胆固醇和总胆固醇测定的药盒可分别购置。

以下是甘油三酯测定的典型反应式:

脂酶

甘油三酯+3H2O──────→甘油+3脂肪酸

甘油激酶

甘油+ ATP+O2──────→3-磷酸甘油+ADP

磷酸甘油氧化酶

3-磷酸甘油+O2──────→磷酸二羟基丙酮+H2O2

过氧化酶

2H2O2+4-氨基安替比林+4-氯酚────→亚胺醌+HCl+H2O

应注意到此反应式中甘油同时被测定。因此象糖尿病控制不佳引起高甘油三酯血症的情况是潜在的误差来源。略去脂酯反应步骤的(空白)对照测定有助于消除这一误差。

一、操作要点

(一)、不论是用于测定游离或总胆固醇和甘油三酯, 每个药盒都配有详细的厂家说明。为了保证结果的准确性和重复性, 务必严格遵照操作规程。酯化胆固醇为总胆固醇和游离胆固醇的差值。

(二)、分析的线性范围是有限的, 所测结果位于标准曲线之外的样本应用0.15M NaCl稀释并重新分析。这在高脂血症的血清样本尤其如此。在测总胆固醇时或测甘油三酯前, 这些样本分别常规进行1:3和1:4的稀释。

(三)、分离的脂蛋白所含胆固醇和甘油三酯浓度的测定与血清中的胆固醇和甘油三酯测定完全一样。将含脂蛋白成分的待测溶液用上述方法分析即可。但在测定分离的脂蛋白中胆固醇和甘油三酯时可能会遇到两个问题:

1. 在某些脂蛋白中(如VLDL)胆固醇和甘油三酯水平较低会导致测定不准确。为解决这个问题, 可加入TBHBA(2.4.5─3溴─3─羟基苯甲酸)以加强颜色反应。TBHBA加入胆固醇颜色反应剂中, 使其混合浓度为0.5%(W/V)而反应剂按正常量配制。在进行测定时也要绘出同含TBHBA样本的标准曲线。

2. 在测定由沉淀法制备的HDL样本中的胆固醇时, 沉淀法用的金属离子(特别是锰离子)干扰胆固醇的氧化反应, 可通过在胆固醇测定试剂中加入EDTA来解决这一问题。通常是在试剂即将使用前于48ml胆固醇试剂中加2ml EDTA(4.17gNa2EDTA 和 3.54g Na3EDTA溶于100ml蒸馏水中)。

(四)、为避免分析中的日常变化及保证结果的准确性和重复性, 在每组分析样本中应设置几个质控样本(每10-15个待测样本中设1个质控样本), 作为组内对照的已知胆固醇和甘油三酯浓度的质控血清有许多厂家提供。另外, 还有一系列外部质控方案。Wellcome Diagnostics公司制定的国际性方案; 在英国Birmingham公司的Wolfson实验室全部使用"国家外部质控评估方案"; 在美国此项工作由"疾病控制中心(Centers for Disease Control, CDC)"完成。他们通过提供已知胆固醇和甘油三酯浓度的样本来对各实验室所测结果的可靠性进行定期评估。

二、脂质测定的重复性和准确性

目前, 对于用于临床疾病研究的脂质(特别是胆固醇)分析的重要性已被进一步受到重视。这是因为测量结果有细微的误差就会产生本质的差别而将病人归于不同的治疗组。应该注意, 血清胆固醇值的生物学变异比实验室误差更为明显。因此,不要把单次的测定值作为重要临床决策的依据。

根据美国国家胆固醇教育计划实验室标准化专家组(NCEP-LSP)的要求, 血浆总胆固醇、甘油三酯和HDL-C的测定结果离靶值的偏差分别不得超过±3%、±5%和±10%, 实验室间测定值的不精密度(CV)分别不得在于3%、5%和6%。