载脂蛋白的定性和定量分析
第一节 载脂蛋白定性分离
样本(血浆或纯化载脂蛋白)可用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、等电聚焦或二维电泳处理。这些方法对于鉴定载脂蛋白的性质、纯度和稳定性等方面是非常适合的。在分析血浆或血浆成分时, 蛋白质在电泳后经过免疫印迹法转移到硝酸纤维素薄膜上, 然后通过免疫方法检测特异蛋白带。
全血样本放入含EDTA的试管中, 使EDTA的最终浓度为1.0mg/dl。立即低速离心后留取血浆样本。然后加入1.0mM苯甲基氟磺酰(PMSF, Sigma), 0.4uM抑肽酶和0.1mM丁羟基甲苯(BHT, Sigma)分别作为蛋白酶抑制剂和抗氧化剂。此样本可在-20℃下保存数月。
所用的试剂包括: 丙烯酰胺、双胺烯酰胺、过氧化铵和四甲基乙二胺(TEMED)均为超级纯试剂, 由Pharmacia-LKB公司提供; SDS(分析纯)由BDH化学药品公司提供; pH范围在4-6之间的两性电解质和Bind Silane由Pharmacia-LKB公司提供。三羟甲基氨基甲烷、硼酸、甘氨酸、甲醇、乙醇、乙醚、脱氧胆酸钠和分析纯的尿素由Merck公司提供; 0.45um的硝酸纤维素薄膜由Scheleicher和Schull公司提供; 三氯化金、4-氯-1-萘酚和β-巯基乙醇由Sigma公司提供; 牛血清白蛋白由Boehringer公司提供; 烷基硫酸钠由Koda公司提供; N-乙基吗啉、三硝基甲苯X-100和硫柳汞(乙汞硫代水杨酸钠)由Dako公司提供。抗兔IgG抗体由Bio Maker公司提供; 抗Apo E、Apo AIV和Apo (a)抗体则由实验室自制。
一、 十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
样本制备: 将20ul样本(含10ug蛋白), 5ul 20%SDS, 0.5ul巯基乙醇和1ul 0.015%溴酚兰甘油混匀并煮沸1分钟。取20ul加入SDS凝胶中。
SDS-凝胶制备和电泳参照Neville法(详见方案1)。凝胶由上部的滞留凝胶和下部的分离凝胶组成。使用Biometra电泳槽, 凝胶完全凝结前,用Bind Silane(15ml Bind Silane 溶于20ml乙醇和5ml 10%醋酸中)处理凝胶上部的玻璃板, 玻璃板下部不应残留Bind Silane。
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方案1: 载脂蛋白的SDS-PAGE法测定
试剂:
(1). 下部分用的6.6%聚丙烯胺凝胶
a. 先用水溶解20.68g 三羟甲基氨甲烷(Tris), 然后加入浓盐酸和水使其pH达9.18及总体积至100ml。
b. 将10.0g丙烯酰胺和0.1g双丙烯酰胺溶于水, 配成25ml混合液。
c. 将120ul四甲基乙二胺(TEMED)与20ml水混合。
d. 将50mg过硫化胺溶于20ml水中。
(2). 上部分用的3.6%的聚丙烯酰胺凝胶
a. 先用水溶解2.62g Tris, 然后加入浓硫酸和水使其pH至6.14,总体积100ml。
b. 将10g丙烯酰胺和1.35g双丙烯酰胺溶于水, 配成总体积25ml的混合液。
步骤:
(1). 将4.2ml Tris溶液, 4.2ml过硫化胺溶液及4.2ml TEMED溶液与1.4ml水混合。
(2). 将混合溶液注入两块处理过的玻璃板(9x9cm, 间有1mm的隔离条)之间, 使凝胶长达7cm。加入几滴水饱和的正丁烷使其表面平整。凝胶聚合后将正丁烷用水洗掉。
(3). 将2.5ml Tris/H2SO4溶液、0.9ml丙烯酰胺溶液、6.5ml过硫化胺溶液及12.5ul TEMED溶液混合。
(4). 将以上混合液加入下部分凝胶之上。
(5). 插入样品梳, 让凝胶发生聚合反应。
(6). 拔出梳子, 然后加样。
(7). 下槽中缓冲液由Tris-HCl(pH9.5)组成: 将5.17g Tris溶于水, 加入2M盐酸使其pH调到9.5. 然后加水使总体积为1升。
(8). 上槽中缓冲液由Tris-硼酸组成: 将2.47g硼酸; 4.92g Tris和1.0g SDS溶于水, 然后加固态Tris和水使其pH至8.64及总体为1升。
(9). 先用10mA/板电泳, 使溴芬兰带聚集, 然后增加电流到20mA/板, 最高电压为200V, 电泳1-2小时。
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6.6%SDS-PAGE法适用于高分子蛋白的分离, 并且是Apo (a)表型定型的第一步。在小分子(分子量<100kDa)的分离和定性时, 需要在10%聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS凝胺电泳。要达到此项要求, 在制备下部聚丙烯酰胺凝胶时需要将丙烯酰胺溶液量由2.8ml改为4.2ml而不加水。
二、 等电聚焦
样本制备: 含蛋白50ug的样本在50ul Tris-HCl(pH8.2)中室温下孵育1小时, 其中含1%烷基硫酸盐, 2%Ampholine(两性电解质, pH4-6), 5ulβ-巯基乙醇和10ul 8%蔗糖, 然后直接加入电泳槽内。
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方案2: 载脂蛋白的等电聚焦
试剂:
(1). 将30g丙烯酰胺、0.8g双丙烯酰胺和36g尿素溶于水, 配成100ml溶液。
(2). 将1mlTEMED和36g 尿素溶于水, 配成100ml溶液。
步骤:
(1). 在7ml丙烯酰胺溶液中加1.2ml Ampholine液, 1.7ml TEMED液, 16ml 8M尿素液和40mg过硫化胺。
(2). 混合后注入两块14x12cm大小(间隔1.5mm厚)玻璃板之间。
(3). 插入样品梳, 让凝胶聚合。
(4). 拔出梳子; 加入样品, 中间由一层1ml80%蔗糖, 0.5ml Ampholinet 8.5ml水组成的混合液,将样品与上层缓冲液隔开。
(5). 将玻璃板装入SE 600平板凝胶系统中(美国Hoefer公司), 在上槽中加0.02M NaOH, 下槽中加0.01M H3PO4。
(6). 在８℃下以250V电压电泳过夜, 开始能量为3W/板, 次日上午加大电压到800V持续1小时。
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三、二维电泳
二维电泳的样本需先按等电聚焦节介绍的方法处理(见方案2)。聚焦后的各凝胶带分别切割并放入pH8.5含0.002M盐酸─甲基吗啉、0.2%SDS、0.1%β巯基乙醇溴酚兰及4%蔗糖的混合液中, 于室温下浸泡15分钟, 然后置于SDS凝胶中再次电泳。此时按Neville的方法进行SDS-PAGE。在下部凝胶中加入丁烷, 凝胶聚合后, 其表面用水冲洗除去丁烷, 然后加入一层下部凝胶缓冲液。在4℃下贮存12小时。最后将上部凝胶溶液(5%丙烯酰胺)混合后注入下层凝胶之下, 使其厚度为1.5cm。将等电聚焦的区带及分子量标准带加入后, 装上电泳仪进行电泳(按方案1)。