四、免疫印迹法(Western Blotting)
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方案3: 硝酸纤维素薄膜免疫印迹的步骤
(1). 将印迹缓冲液中的聚丙烯酰胺凝胶置于硝酸纤维素薄膜上(BA85, 0.45um)。
(2). 将3mm厚湿润的滤纸贴于两侧, 然后装入印迹盒内(型号TE42; Hoefer)。
(3). 用192mM甘氨酸, 25mM Tris和20%甲醇的水溶液作为印迹缓冲液。
(4). 在180V电压下进行1小时印迹处理, 将Apo E和Apo AIV吸收。 Apo (a)的吸收需要在80V电压下印迹12小时, 温度控制在10℃。
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另外一种可选择的免疫印迹法是用TE70 Semiphor仪(Hoefer科技仪器公司)进行的半干印迹法。半干印迹法(见方案4)的缓冲液由5.82g Tris、2.93g甘氨酸、1.9ml 20%SDS及200ml甲醇溶于1 升水中形成。
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方案4: 用半干技术进行免疫印迹的替代方法
(1). 电泳后立即将凝胶浸于印迹缓冲液中15分钟, 使其平衡。
(2). 将与凝胶片同样大小的5张滤纸和硝酸纤维素薄膜浸于同一缓冲液中。
(3). 在TE79的阳极顶端依次放上3 张经缓冲液饱和过的滤纸片, 随后依次放上经缓冲液浸泡过的硝酸纤维素薄膜、凝胶及另外两张滤纸。在建立上述"夹心层"时, 应避免每层之间产生气泡。
(4). 将盖板(阴板)放在上述夹层柱的顶部并用1公斤重物加压。
(5). 以250mA电流及15V电压进行电泳转移, 根据蛋白质颗粒大小, 常规下转移时间分别为30分钟(蛋白小于80kDa)及45分钟(Apo B 和Apo (a))。
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五、 免疫检测
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方案5: 脂蛋白免疫检测方法
试剂:
(1). 缓冲液A: 10mM Tris-HCl(pH9.0), 0.15M NaCl, 0.01%硫柳汞(乙汞硫代硫酸钠), 0.02%偶氮化钠(NaN3)。
(2). 缓冲液B: 缓冲液A加0.1%SDS, 0.2%三硝基甲苯X-100. 0.25%脱氧胆酸钠。
(3). 缓冲液C: 缓冲液A加1%牛血清白蛋白。
(4). TTBS: 在2.5升TBS溶液中溶解1.25g Twin 20(聚山梨醇酯20)。
(5). TBS: 将50ml 1M Tris-HCl(pH7.4)和73gNaCl溶于钬水中配成总体为2.5升的混合液。
(6). 过氧化酶底物溶液: 60mg 4-氢-萘酚, 20ml 甲醇, 100mlTBS和60ul过氧 化氢。
步骤:
(1). 印迹后, 将硝酸纤维素薄膜放在缓冲液C中37℃下封闭0.5小时。 然后浸入加有特异兔抗Apo AI、ApoE.AIV多克隆抗体或鼠抗Apo (a)单克隆抗体的缓冲液C中。根据抗体各自的浓度, 其稀释范围在1:100─1:1000内变化。
(2). 在室温下将硝酸纤维素薄膜孵育2小时, 用缓冲液A短时清洗两次, 在缓冲液B 中冲洗两次(5分钟), 然后再在缓冲液A中冲洗两次。
(3). 继而将硝酸纤维素薄膜浸入含有抗抗体[过氧化酶标记针对单克隆抗体的抗鼠IgG(1:1000)抗体或已标记的针对多克隆抗体的抗兔IgG(1:150)抗体]的缓冲液C中在室温下孵育2小时, 金标记的抗体立即显色, 而过氧化酶染色需进一步冲洗。为使过氧化酶显色, 将硝酸纤维素薄膜在TTBS(Tris缓冲盐水+吐温)中冲洗共10分钟。
(4). 最后将硝酸纤维素薄膜放入过氧化酶底物溶液中孵育10-40分钟, 直至出现深暗的紫黑色。
(5). 此后, 用水充分清洗硝酸纤维素薄膜, 并可将其在暗处保存。
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六、 金标记抗体
第一步是需制备金溶胶, 将40mg AuCl3溶于400ml双蒸馏水并在回收瓶内煮沸半小时, 必须保证水和玻璃器皿不含有其他任何微量金素。然后加入10ml0.1M枸椽酸钠, 再将此混合物煮10分钟, 此金溶液可保存数月。
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方案6: 金标记抗体方法
(1). 将10ml金溶胶与200ml 0.1M聚乙二醇混合; 接着用0.1M K2CO3滴定到pH7.6, 计算所需K2CO3的准确量(=X)。
(2). 用双蒸馏水将抗体溶液稀释至1:10然后将此贮存液稀释成一系列不同比例的溶液, 比例为1:2至1:32, 每份体积为1ml。
(3). 在上述这些稀释液中(100ul)加1ml金溶胶液和K2CO3使其pH为7.6。
(4). 10分钟后, 加入100ul 10%NaCl并观察其颜色变化(从红色变为紫色), 其中保持红色不变的最低抗体稀释浓度(1:Y)为金溶胶与抗体溶液结合的适当混合比例。
(5). 金标记的最终步骤是将150ml金溶胶, 15 x X ml K2CO3(使pH为7.6),15ml 抗兔IgG抗体(1:10)x(1:Y)和3ml 0.1M聚乙二醇混合。
(6). 用玻璃管在4℃下以10000r.p.m.速度将以上混合物离心2 小时。将丸状的金标记抗体溶于3ml 0.1M K3PO4溶液(pH7.4)中。其中含有4%聚乙烯吡咯烷酮,0.2mg/ml 0.1M聚乙二醇和0.05%偶氮化钠溶液。
(7). 将此溶液以10000r.p.m速度离心半分钟, 然后弃去底层的小团。从而金标记抗体就可用于免疫染色, 使用时稀释200倍。
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八、 载脂蛋白变异和多态性检测
用等电聚焦的方法可检测血浆中Apo AI、AII、AIV和E的常见变异和多态性。Apo (a)的大小多态性是用SDS-PAGE法从还原血浆中检测。电泳后蛋白成分通过免疫印迹法转到硝酸纤维素薄膜上。特异的蛋白带用免疫方法检测。
(一)、 Apo AI、AII、AIV
将4ul血浆与50ul含1%SDS和2%ampholin(两性电解质载体, pH4-6)、5ulβ－巯基乙醇和10ul10%蔗糖的0.01M Tris-HCl(pH8.2)混合液在室温下孵育1小时, 然后将其直接加入电泳槽内。
(二)、Apo E 按前面介绍的方法, 用2.5ml乙醇:乙醚(3:1)混合液在-20℃下对10ul血浆进行12小时脱脂处理。将沉淀物在-10℃下以5000r.p.m速度离心10分钟。然后在-10℃下用乙醚清洗一次, 时间1小时, 离心后, 将沉淀物溶于200ul含0.1MTris-HCl(pH10.0)、6M尿素、10%烷基硫酸钠和2ulβ-巯基乙醇的混合液中, 在4℃下放置半小时, 加入20ul于等电聚焦的凝胶上。
(三)、Apo (a) 将20ul血浆放入50ul 5%SDS、0.02M盐酸N-乙基吗啉(pH8.5)、2ul β-巯基乙醇和4ul 0.015%溴酚兰甘油液的混合液中煮沸。将5ul上述混合液加到6.6%SDS-聚丙烯胺凝胶上。