第二节 载脂蛋白定量分离
一、Apo AI和Apo AII的分离
人类血浆Apo AI、AII可从HDL中分离出来, 而HDL是通过制备性序贯离心法从正常人禁食血浆中获得。
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方案 7: Apo AI和Apo II定量分离方法
(1). 用固态KBr 将血浆密度调至1.063g/ml。用Beckman 50.2Ti转子在5℃下以50000r.p.m超速离心24小时。弃去VLDL和LDL成分。
(2). 将下沉液(用管切法获得)密度调到1.21g/ml, 然后在同一转子内, 以50000r.p.m在5℃下离心48小时。
(3). 此次离心的上清液中含有HDL, 然后将上清液用pH7.1的1mM EDTA进行透析处理。
(4). 将透析过的HDL放入6M盐酸胍溶液中37℃孵育3 小时。
(5). 再将其用1mM EDTA(pH7.4)透析处理一次, 同时将HDL液的密度调至1.21g/ml, 在5 ℃下以50000r.p.m离心24小时。
(6). 浮于上层的溶液中含有Apo AII, 下层液中含有Apo AI。将两者用0.15MNaCl和1mM EDTA(pH7.4)透析处理, 并在-20℃下用乙醇/乙醚(3:1)混合液脱脂处理3 次。
(7). 将去脂样本溶于30mM Tris-HCl(pH8.6)和6M尿素液中, 然后放入阴离子层析柱内, 用300ml线性梯度盐溶液以4ml/分流速进行洗脱以获得纯的Apo AI和Apo AII。
(8). 将各种含纯载脂蛋白成份的分部收集起来, 用PBS进行透析处理, 最后在-20℃下保存(1mg/dl)。
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Apo AI和AII纯化的其他方法包括: 对超速离心制备的HDL进行羟基磷石层析分析。对全血浆进行亲合层析分析以及对去脂HDL成份进行层析聚集或反相层析分析。 以上方法有些很费时, 有些则不能获得满意的纯度, 因而多数人喜欢采用相对简单的离子交换层析分析。
二、Apo AIV的分离
人类Apo AIV是用甘油三酯-磷脂乳胶吸收法及脱脂脂质结合蛋白阴离子变换层析法从去脂蛋白血清中纯化而来的。
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方案8: Apo AIV定量分离方法
(1). 将500ml密度1.25g/ml的血清以50000r.p.m超速离心, 弃去上浮的脂蛋白, 即得到去脂蛋白的血清样本(LPDS)。
(2). 用0.15M NaCl、50mM K3PO4(pH7.4)及0.05%依地酸二钠对上层清液进行透析处理。
(3). 同时制备400ml脂肪乳剂: 将400ml脂肪乳剂用SW28转子(Beckman)在4℃以25000r.p.m离心35分钟后, 留取上浮脂质, 并用PBS使其恢复到原来体积(400ml)即可。
(4). 将400ml去脂蛋白血清与400ml PBS、225g NaCl、160ml脂肪乳剂(已制备的)混合, 用KOH调至pH7.4, 在37℃下振摇水浴孵育。
(5). 用SW28转子在4℃下以27000r.p.m离心20分钟将脂肪乳剂再分离, 然后用10ml PBS使上清液悬浮, 最后用50mM Tris-HCl(pH8.2)进行透析处理。
(6). 将透析过的溶液用小号针头直接注入1000ml乙醇/乙醚(3:1)混合液中进行脱脂处理。在-20℃下孵育24小时, 然后将沉块离心并使其再悬浮。
(7). 重复上述步骤, 分别取800ml孵育24小时, 400ml孵育4小时, 80ml孵育24小时及80ml孵育3小时进行脱脂处理。最后一步脱脂过程是用30ml乙醚孵育2 小时 。以上所有孵育过程都是在-20℃下进行。
(8). 将脱脂处理的沉块溶于7.2M尿素和10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液中。用N2使残存的乙醚蒸发。再离心一些不能溶解的物质, 其上层液就可用阴离子交换层析进一步纯化。
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快速蛋白液相层析分析(FPLC)系统结合Mono Q HR16/10层析柱可使Apo AIV与其他脂肪乳剂结合蛋白分离。这个系统由二个P-500梯度泵和一个形成梯度的GP/-250梯度程控器组成。洗脱过程由紫外线监测仪在280nm波长处及记录紫外线吸收的图形描记仪进行监控。所有层析分析过程均在室温下进行。分析柱用10ml Tris-HCl(pH8.0)和7.2M尿素以1ml/分流速进行平衡处理, 并使用含Apo AIV的液体。然后用150ml 0-300mM NaCl线性梯度液以1 ml/分流速进行洗脱。洗出成份立即进行透析以清除尿素。最后用15%SDS-PADE及Western印迹法进行分析。此种层析分析洗脱出3个主峰值: 第一峰主要含Apo AI, 第二峰含纯Apo AIV, 第三峰主要含白蛋白。
三、Apo E的分离
采用制备性SDS-PAGE从VLDL中分离出Apo E。
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方案9: Apo E的定量分离
(1). 按LDL分离的方法用超速离心将VLDL从血浆中分离出来。
(2). 用乙醇/乙醚(1:1)在-20℃下脱脂处理12小时, 从中提取VLDL中载脂蛋白。
(3). 用不连续缓冲系统进行制备性PAGE, 其中丙烯酰胺凝胶浓度为15%。在2ml含2%SDS、1%2-巯基乙醇及0.04M Tris-硼酸(pH8.64)的混合液中溶入载脂蛋白50mg, 并在100℃下煮沸3分钟。
(4). 在样本中加甘油, 然后将其加入垂直凝胶柱中。给予恒定电压50V以产生8mA左右的电流。
(5). 用0.02M乙基吗啉/盐酸缓冲液(pH9.2)以4.4ml/小时的流速进行洗脱。在280nm波长下监测液流。收集每份2ml的洗出液。将各份Apo E混合成一管, 这可用SDS-PAGE及免疫印迹法进行监测。
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制备性SDS-PAGE还可在垂直平板凝胶系统中进行。预备1mm厚的5-20%丙烯胺梯度凝胶。将15mg载脂蛋溶于2ml液体中(该液体含0.125M Tris-HCl, pH6.5, 2%SDS, 10%甘油及3%β-巯基乙醇), 按前述方法煮沸。然后将其加于凝胶上。使用恒定电流20mA直至电压达300V。电泳后按制备Apo B48的方法用KCl使蛋白带显示。ApoE带被切除并用蒸馏水从凝胶上洗出。然后用10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.05%SDS透析清除KCl, 最后冻干处理。
Apo E也可用SDS凝胶滤过层析法从脱脂的VLDL中提纯出来。这种分离是在室 温下采用2.5x100cm大小的Sephade G-200层析柱(Pharmacia)进行。此层析先用0.01M乙基吗啉/盐酸、0.1%SDS及1mM DTE进行平衡。