四、Apo C的分离
三种Apo C均可用同样技术分离: 即从脱脂VLDL开始, 然后进行凝胶滤过层析分析(去掉较大的Apo E和Apo B), 最后进行阴离子交换层析分析。VLDL及其脱脂的制备按Apo E分离的方法进行。
凝胶滤过层析分析是在1mM烷基硫酸钠中进行, 含Apo C的成份收集后用DEAE(二乙基氨基乙醇)阴离子交换层析柱在8M尿素中进行层析分析。含每类Apo C的成份收集后用PD-10柱进行去盐处理。从DEAE层析分析中收集的Apo CII冻干处理后, 用sepharose G-75分析仪在含0.01M tris-HCl(pH8.6)和5.4 M尿素缓冲液中再进行层析分析。
另外, Apo CII-CIII的提纯还可采用新近介绍的制备性高压液相色谱分析法,将VLDL脱脂后的蛋白成份溶于0.01M Tris-HCl(pH8.2)及6M尿素混合液中, 然后以3000g 离心15分钟以清除不溶性物质(主要为Apo B)。将含有可溶于尿素的VLDL所含载脂蛋白(约3mg)上层清液加于Varian型540高压液相色谱分析仪的反相层析柱上, 此分离过程是在室温下用50mM醋酸氨(pH6.0)作为A溶剂, α-丙烷作B溶剂进行梯度洗脱。洗脱梯度为从100%A溶剂到A、B溶剂各50%, 流速为1ml/分。Apo CII和CIII成分收集后, 用快速真空冻干法进行浓缩, 并按前述的方法再次层析分析。注射前每个样本用0.22um微孔的滤纸(GS型)滤过处理。
C类载脂蛋白定量分离的另一种方法是用预备性大小分离层析分析脱脂后HDL的载脂蛋白。HDL是由经典的序贯超速离心进行预处理。并用乙醇/乙醚混合液脱脂。脱脂后HDL中的Apo混合物再用Varian Model5060层析分析仪和Micro Pak TSK3000 SW制备性高压液相层析分离。
五、Apo B100和B48的分离
由于这两种蛋白的分子量大, 且具有疏水性, 因此在不用去垢剂的情况下, 不可能在无脂状态下使他们纯化。下列方案是介绍相应脂蛋白类(分别为LDL和乳糜微粒)的提纯方法。
(一)、LDL的分离
LDL的提纯是通过多次密度超速离心完成的。然后, 用多种技术清除其伴有的血浆蛋白和脂蛋白其他成份[白蛋白、Apo A类、Apo C类、Apo E及Lp(a)]。既使将LDL再次离心, 也不能将Lp(a)与LDL分离。
───────────────────────────
方案10: Apo B的分离方法
(1). 以低速离心分离出新鲜血浆, 然后加入硫酸庆大霉素(0.1mg/ml)、氯霉素(0.05mg/ml)和重氮化钠(0.2mg/ml)以防止Apo B被细菌降解。 加入EDTA(1mM)和PMSF(0.05mg/ml)以防止其被蛋白水解酶降解。所有缓冲液及密度液均需含有这些添加剂。
(2). 用50.2Ti Beckman转子以40000r.p.m速度在5℃下按血浆密度(d=1.006g/ml)离心18小时, 然后将VLDL及乳糜微粒从血浆中清除。最后用固体KBr调节下层液密度到1.063g/ml, 再将其用同一转子以50000r.p.m在5℃下离心24小时。
(3). 用吸取法或管切法留取上浮物(含LDL)。
(4). 进一步提纯的方法包括: 制备性SDS-PAGE阴离子交换层析法, 人工脂质乳胶结合及免疫亲合层析法。
───────────────────────────
阴离子交换层析分析前, 超速离心分离出的LDL要用50mM NaCl 和10mM Tris-HCl(pH7.4)混合液进行透析处理。将其加入Hiload 16/10Q Sepharose层析柱上。此柱使用前用同一缓冲液进行平衡处理。其洗脱过程采用FPLC系统, 在室温下用120ml 50-500mM NaCl线性梯度以1ml/分钟流速洗脱。这样分离出的LDL不会混有其他的蛋白类, 这可用银染色PHAST SDS-PAGE法进行监测。
另外, LDL也可与英脱利匹特(Intralipid)在37℃下孵育29小时。继而以20000g离心30分钟。通过此方法, Apo A及Apo C类可因其脂肪乳胶的高亲合力而被分离。其他蛋白通过免疫亲合层析连续去除, 该层析柱上亲和纯化的多克隆抗体与相应蛋白共价结合。
(二)、Apo B48的分离
该载脂蛋白可通过制备乳糜微粒, 脱脂处理及制备性SDS-PAGE法获得。乳糜微粒可从淋巴液中用50.2Ti转子以39000r.p.m在4℃下超速离心18小时获得。收集上层液体, 再悬浮于PBS中, 重复离心(条件同上)。乳糜微粒用乙醇/乙醚(3:1)脱脂, Apo B48通过制备性5%SDS-PAGE法分离。脱脂样本的制备与分析性PAGE要求相同。凝胶和两个槽中的缓冲液都是含有0.1mg/ml的硫酸庆大霉素和偶氮化钠(0.2mg/ml)。为使蛋白带显色, 凝胶置4℃0.2M KCl中孵育过夜。KCl可使凝胶中的SDS沉淀。
六、Lp(a)的分离
选择血浆Lp(a)浓度大于50mg/dl的供血者提供分离Lp(a)用的全血浆。600ml上述血浆中加入下列抗蛋白水解酶及抗微生物试剂: 0.26ml PMSF (100mg/ml乙醇),120mg NaN3, 60mg邻巯基苯甲酸乙基汞化钠, 0.45ml抑肽酶(2mg/ml)及0.6ml 0.5M Na2EDTA。
纯化方案由一个连续的超速离心过程组成。若需要Apo (a), 可将纯化的Lp(a)二硫化还原剂孵育, 使之离解为Apo B和含Apo (a)含两部分。然后进行再次超速离心使LDL成分上浮, 而Apo (a)沉于管底。
───────────────────────────
方案11: Lp(a)的分离方法
(1). 应用50.2Ti Beckman转子, 血浆用量480ml, 血浆密度用固体KBr调至1.063g/ml, 在20℃下以49000r.p.m超速离心48小时。
(2). 从离心管中部抽吸回收含Lp(a)的脂蛋白成分。试管上部为漂浮的VLDL和LDL, 而底层为HDL和其他血浆蛋白成分。
(3). 然后调节Lp(a)部分密度至1.10g/ml, 20℃下以49000r.p.m离心20小时。这样可使剩余的HDL杂物沉于管底, 而含Lp(a)的脂蛋白成份上浮。
(4). 为提取Apo (a)蛋白, 将第二次超速离心提纯的Lp(a)与1mM二硫代1.2.3.4丁四醇(DTE)在室温下孵育1小时。孵育应在充满N2的封闭玻璃管内进行。
(5). 孵育后, 将Lp(a)制备品置于SW41 Beckman转子中, 以40000r.p.m在20℃下离心3小时。离心之前, 先将3ml初始密度为1.10g/ml的Lp(a)制备品置于3ml密度1.035g/ml及2ml密度1.019g/ml的溶液之下。最后, 大约有4 ml密度1.21g/ml溶液置于管底。
(6). 超速离心后, 回收管底3ml含Apo (a)的溶液。
(7). 最后用0.2mM乙基吗啉(pH8.5)对Apo (a)制备品进行透析处理。并加入抗蛋白水解和抗微生物试剂。
────────────────────────────
另外, 第一次超速离心后的含Lp(a)成份还可通过Sepharose 4B柱凝胶过滤层析进一步纯化。5ml含200-250mg蛋白的脂蛋白溶液用洗脱缓冲液(0.1M Tris-HCl,pH 9.0)透析后上柱(2.5x100cm)收集5ml洗出液, 280mM检测蛋白质, 并通过SDS-PAGE和免疫印迹筛选出Lp(a)。
还有一种方法, 即以抗Apo (a)亲合柱进行免疫亲合层析, 第一次超速离心所获的含Lp(a)部分直接上柱(最好加入到封好的柱上旋转过夜), 以PBS洗涤, 并用含0.2M甘氨酸-HCl(pH2.0)及6M脲和0.15M NaCl的缓冲液洗脱, 洗脱液马上用1M K2HPO4(pH9.8)中和, 并用PBS透析, 最后加入抗蛋白水解酶和抗微生物试剂。
赖氨酸-Sepharose亲合层析是利用Apo (a)与赖氨酸结合的特性(因为其与纤溶酶原同源), 因此也是一种提纯Lp(a)的方法。血浆超速离心后富含Lp(a)的部分用0.1M磷酸盐(pH7.4), 1mM EDTA透析, 然后加到7x2 cm的赖氨酸-Sepharose 4B柱上,此柱用同样缓冲液平衡。洗掉未结合的蛋白质, 结合在柱上的Lp(a)可用含50mM 6-氨基已酸的上述相同缓冲液洗脱。