高密度脂蛋白和低密度脂蛋白亚类分离

    大量的研究证实, 无论是高密度脂蛋白(HDL)还是低密度脂蛋白(LDL)其颗粒大小都是不均一的, 采用多种方法可将这两类脂蛋白进一步分成许多亚类。 各亚类脂蛋白的代谢特点和临床意义都有不同。

第一节  从血浆中分离总HDL

    一、制备性超速离心法

    将高密度脂蛋白(HDL)分离为各亚类前, 通常必须先从血浆中分离出总HDL。常采用的方法是浮选制备性超速离心法。应特别强调的是, 要使用新鲜未冰冻的血浆样本, 以防HDL亚类的组成和性质发生变化。但在某些情况下(如只需用梯度凝胶电泳做进一步分析时), 使用在-20℃贮存已2月的血浆样本仍可获得满意的结果。由于溶液中盐浓度和方法固有的高引力可使某些载脂蛋白(Apo AIV、E和C)从HDL颗粒中大量游离出来, 所以必须严格控制标准条件, 特别是离心次数, 以保证在不同的制备中得到相同的结果。应用该方法作定量分析时其回收率大约为92-96%。

    (一)、试剂

    按表3-39-1中所列数值制备一系列不同密度的溴化钠(NaBr)溶液。用蒸馏水溶解NaBr, 总体积为1升。用密度计测定这些溶液的密度, 加固态NaBr或蒸馏水将密度调至要求值。制定所需密度溶液的最简便方法是: 先配好比要求密度大得多的溶液, 再按下列公式计算, 将高密度溶液稀释至所需密度的溶液。

       X=(d2-d1) /(d1-1)

    其中X=配制所需密度时加入1ml NaBr溶液所需的蒸馏水体积(ml); d1=所需的密度, d2=测定的密度。

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                    表3-39-1. 不同密度NaBr溶液的制备

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溶液            要求密度       NaBr量         Na2EDTA        最终体积

               (d1)           (g)             (g)             (ml)

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(a)             1.063          7.6             0.37           1000

(b)             1.117          13.8           0.37           1000

(c)             1.187          20.9           0.37           1000

(d)             1.210          23.2           0.37           1000

(e)             1.295          30.5           0.37           1000

(f)             1.357          34.2           0.37           1000

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    方案1: 用制备性超速离心浮选分离血浆中总HDL

    (1). 收集血样本, 将其与Na2EDTA(终浓度1mg/ml)在干试管内混合。或者直接用含Na2EDTA的空针抽血。

    (2). 血样本以1500g 4℃下离心10分钟, 移出上清血浆。

    (3). 在给定的血样本体积中加入等体积的(b)溶液(见表6-4, 密度1.117g/ml)以形成终密度为1.063g/ml的溶液。由于不同次操作可能造成的误差, 需仔细测定溶液的密度, 必要时要调节密度至1.063g/ml。

    (4). 将配制好的血浆放入超速离心管, 盖好盖子。加入每管中的血浆应有所限量, 以防开盖时破坏上层。但离心管中血浆也不能太少, 否则在离心力作用下管子会内陷。假如是用Beckman制备性超速离心管(16X76mm), 其内应放入10.4ml血浆。假如最后一支配制的试管内血浆体积不足10.4ml, 应加入(a)溶液(密度1.063g/ml)以补足体积。

    (5). 检查每管是否平衡, 如有必要, 在平衡管中加入(a)溶液使其达到平衡。

    (6). 用固角转子(Beckman 40或50 Ti型)以40000 r.p.m(105400g)16℃下离心18hr, 在不用制动闸的情况下让转子缓慢停止。

    (7). 从转子中小心取出离心管, 一次只取一支, 揭开盖子, 收集含VLDL和LDL的上部分液体, 即微红色的HDL层和管底血浆蛋白层之上的一半清亮液体。采用移样器或Beckman管切机。后者应确定管切的位置, 应在距管顶端3-4cm处切割。    (8). 用细玻璃棒搅拌每管内的剩留物(下层液), 使通常存在于管底的含HDL的胶状"板块"(pellet)再悬浮。

    (9). 收集下层液, 加入等体积溶液(密度1.357g/ml)至最终密度为1.21g/ml.用密度计测量以确保其终密度为1.21g/ml。若密度不足, 可采用加入固体NaBr的方法, 以免体积明显增大。

    (10). 将调好的溶液加入离心管(同上第4步骤), 用溶液(d)将各离心管平衡。

    (11). 以40000rpm在16℃下离心40hr。

    (12). 取出体积约2ml的全部上层液。如需要定量回收, 可在距顶端2ml处用管切法收集上层约1.5ml的液体, 再在量杯中用溶液(d)将体积加至2ml。通常要保证整个HDL层都被收集到, 避免任何细小、稠密及粘滞的HDL颗粒损失。为达到此目的,必要时可增加HDL的收集体积。

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    二、沉淀法

    用沉淀法分离血浆中HDL成份, 尽管该方法在临床研究中有一定的价值, 但此方法在HDL亚类分析上的应用却有限。因为通过该方法获得的终产物虽不含其他类脂蛋白, 但仍为HDL与血浆蛋白的混合物, 因此不适合HDL亚类的进一步分离。此外, 沉淀法分离脂蛋白时对其颗粒的破坏性并不比超速离心法小。