第二节  HDL2和HDL3分离与测定

    一、制备性超速离心法

    采用的方法与上述方案1介绍的方法相同。只是增加一个密度为1.125g/ml的步骤。此方法的优点在于能得到较纯的HDL2和HDL3, 并可用于进一步的分离亚类。对于高甘油三酯血症病人, 该法比沉淀法能提供更可靠的结果。

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    方案2: 浮选超速离心法分离HDL2和HDL3

    (1). 按方案1中的1-8步进行。

    (2). 在收集的下层液中加入等积的溶液(密度1.187; 见表6-4), 使其终密度的1.125g/ml。

    (3). 以40000 rmp在16℃下离心40hr。

    (4). 取出2ml含HDL2的上层液。

    (5). 在下层液中加入等体积的溶液(密度为1.295g/ml). 使其终密度为1.21g/ml。    (6). 以40 000 r.p.m在16℃下离心40hr。   

    (7). 收集2ml含HDL3的上层液。

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    二、沉淀法

    由于Gidez-Eder法的简单易行, 已被广泛用于测定血浆HDL2和HDL2浓度的临床研究。该方法的理论依据是含Apo B的脂蛋白可用肝素-MnCl2从血浆中沉淀下来, 而总HDL和其他血浆白蛋白被残留在上层清溶液中。再加入硫酸右旋糖酐使HDL2成份从溶液中沉淀下来, 而HDL3成份则仍残留在上层清溶液中。

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    方案3: 沉淀法分离HDL2和HDL3

    试剂:

    (a). 肝素: 将490mg肝素钠盐(Sigma)溶于2ml蒸水。

    (b). 1.06 M MnCl2: 209.8g MnCl2.4H2O溶于蒸馏水, 加水至终体积1升。

    (c). 肝素/MnCl2溶液: 将1.5ml溶液(a)加入25ml溶液(b)中, 其最终分析范围内浓度为肝素1.26mg/ml, MnCl2 0.091M。

    (d). 硫酸右旋糖酐溶液: 将1.43g硫酸右旋糖酐(分子量15000, Sochibo)溶于0.15M NaCl中, 并用0.15M NaCl加至100ml。必须使用指定的硫酸右旋糖酐, 使其分离结果具有可重复性。

    步骤:

    (1). 3ml血浆中加入0.3ml肝素/MnCl2, 彻底混匀,  室温下放置10-20分钟。

    (2). 以1500g在4℃下离心1hr。立即取出部分透明上清液进行下一步操作, 并同时进行总HDL测定。

    (3). 在2ml上层清液中加入0.2ml硫酸右旋糖酐溶液, 彻底混匀, 室温下放置20分钟。

    (4). 以1500g在4℃下离心30分钟, 立即取出部分透明上层清液作HDL3-胆固醇(C)测定。

    (5). 总HDL-C和HDL3-C浓度测定后, HDL2则等于总HDL-C减去HDL3-C。应注应该注意的是该方法并未能使HDL2或HDL3从血浆蛋白中游离出来。

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