第三节 HDL亚类的分离
一、梯度凝胶电泳
(一)、原理
梯度凝胶电泳的一般原理在前面已作介绍。尽管该项技术可将大多数蛋白混合物分离成清晰的非连续性带, 但因HDL的高度不均一性, 而常产生宽而重叠的带。但是该方法所获结果重复性好, 所以是一种定量测定HDL亚类的可靠方法。
(二)、聚丙烯酰胺梯度凝胶
通常分离HDL类所用的凝胶为4-30%线性梯度的丙酰胺凝胶, 但是当LDL或其他脂蛋白存在时, 则凹面胶更有用。市售的预制胶(如Flowgen, 以前大部分采用Pharmacia凝胶, 但此类产品最近已停产)尽管昂贵但却很方便。但有报道说它们不适合用于将被测物转移到硝酸纤维素薄膜上进行免疫学的蛋白分析研究, 因为其转移效率极低。为达此目的, 研究者应自制梯度胶。但是, 实验室制的凝胶缺少预制胶的精确性及可重复性, 因而可能不适合定量研究。尽管实验室自制的凝胶梯度设备可产生满意的结果, 但制梯度胶的最好方法是采用凝胶制备盒(Pharmacia/LKB; Bio Rad)。
(三)、 电泳
1. 试剂
(a). 0.09 M Tris/0.08 M 硼酸/3 mM EDTA, pH 8.35 (贮存缓冲液): 将1.090g Tris、4.95g H3BO3和1.12g Na2EDTA 溶于蒸馏水, 调节pH至8.35, 加水至1升。
(b). 5-磺基水扬酸(10%): 50g 5-磺基水扬酸溶于蒸馏水, 体积加至500ml。
(c). Coomassie蓝染色液: 0.01g Coomassie亮蓝R50 溶于甲醇:乙酸:水(5:1:4,V/V/V)混合液中, 将总体积用混合液加至1升。
2. 样本制备
测定总HDL时, 直接采用经密度1.21g/ml进行超速离心时所分离的样品, 不必透析处理。若要研究所分离HDL的亚类, 用(a)缓冲液透析样本(必要时在浓缩后), 并将4份样本溶液与1份含40%蔗糖的(a)缓冲溶液混合(以帮助样品沉积到凝胶表面)。HDL或其亚类样本可在4℃下存放24小时。
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方案4: 电泳分离脂蛋白的方法
(1). 将已充填凝胶的玻璃夹层装入电泳槽中。
(2). 将样本梳水平位紧压置于凝胶顶部, 确保样本梳底部与凝胶之间没有空隙, 以防邻近加样孔之间样品扩散。但同时要注意, 不要撕坏或压碎凝胶。
(3). 槽中加入适量的(a)缓冲液, 用加样器将缓冲液注入各孔, 并去除孔内的气泡。
(4). 凝胶于70V预平衡20分钟。
(5). 关上电源, 用自动加样器小心地在预制孔中加入10-20ul样品(含15-20ug蛋白), 其中两孔中加入相当体积的标准蛋白混合物, 以校准颗粒直径大小(如Pharmacia的HMW标准盒, 含甲状腺球蛋白、去铁蛋白、过氧化氢酶、乳酸脱氢酶及牛血清白蛋白)。
(6). 在20V电压下电泳20分钟, 然后70V电泳30分钟, 最后以120V电泳24小时。
(7). 关电源, 从电泳槽中取出凝胶夹层, 分开玻璃板, 并立即将凝胶置于(b)液中固定1小时。然后用Coomassie蓝即(c)溶液染色1.5小时, 再用甲醇:乙酸:水(5:7.5:87.5, V/V/V)混合物脱色数天。此间轻轻水平摇动并经常换洗涤液。凝胶存于9%的乙酸中, 这样染色带在室温下至少在3个月内可保持稳定。
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(四)、密度测定法
肉眼观察分离HDL亚类的照相记录在大多数情况下已经足够, 但有时条带复杂而重叠, 在要求精确结果时必须对条带区域进行扫描测定。许多仪器均符合此要求(Bio Rad 620 显像密度测定仪, Pharmacia/LKB扫描XL激光密度测定仪, BeckmanAppraise, Joyce Loebl色谱扫描仪)
梯度凝胶电泳将人类HDL分为五个亚类, 它们的RF范围见表6-5所示。其中两个亚类(HDL2a和HDL2b)与另三个亚类(HDL3a、HDL3b、HDL3c)分别与超速离心分离的HDL2与HDL3相应。这种方法所获得的HDL亚类平均颗粒直径与电镜及分析性超速离心测定的结果相符。此方法提供了划分HDL亚类的一套实用而系统的基础。因此, 表3-39-2所示RF范围内的亚类分布, 应通过测定此范围内吸收峰值面积来确定。在此表中RF值为特定HDL亚类峰与标准品BSA峰迁移距离的比值。
表3-39-2. 梯度凝胶电泳分离HDL亚类
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HDL亚类 RF范围 平均直径(nm)
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HDL3c 0.841-0.962 7.62
HDL3b 0.781-0.841 7.97
HDL3a 0.711-0.781 8.44
HDL2a 0.627-0.711 9.16
HDL2b 0.445-0.627 1.057
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不同个体这些HDL亚类的分布存在着显著差别。但只要保持某一恒定的生活习惯, 大多数人的分布图形基本保持一致。体育锻练、饮食调节、饮酒习惯及服用某些药物均可引起某一特定HDL亚类水平的显著变化。冠心病高危患者及心肌梗塞存活者HDL2水平显著低于对照者。用梯度凝胶电泳将多种实验动物(如鼠、兔)的HDL分离成各亚类, 其分布与人类的相似。但是, 它们的亚类颗粒常比人类的大。
应引起注意的是, 用这种方法分离出来的HDL亚类仍是不均一的。也就是说, 虽然这些亚类HDL颗粒大小相同, 但其组成成份不同, 并在代谢中起着不同的作用。
二、肝素─葡聚糖凝胶(Sepharose)亲合层析
(一)、原理
肝素─葡聚糖凝胶能与含Apo E的HDL亚类结合, 这一发现使得此方法被广泛应用。因为富含Apo E的HDL能与组织受体互相作用, 并有报道认为它能阻碍胆固醇的转运。因此该方法能提供与代谢参数有关的分离结果。用此方法分离出的富含Apo E的HDL, 在Apo E含量方面亦具有不均一性。最近开展了一些实验, 用一系列不同离子成份的洗脱溶液分离富含Apo E不同的HDL亚类, 以研究这些组分的代谢作用。
(二)、肝素─葡聚糖凝胶的制备
偶联的肝素─葡聚糖凝胶市埸有售, 也可按操作说明(Pharmacia/LKB)用活化的Sepharose在实验室配制, 有些学者发现此类产品的结果并不十分满意, 且重复性差。在实验室全部配制肝素和葡聚糖凝胶, 尽管很费力, 但其产品具有很高的结合力, 并可获得重复性好的定量结果。
1. 试剂
(a). 2M Na2CO3: 21.2g Na2CO3溶于蒸馏水中, 体积为100ml。
(b). 溴化氰/乙腈: 10g CNBr(新鲜的)溶于5.0ml乙腈中, 用前配制, 于冰中放置。
(c). 0.2M NaHCO3(pH9.5): 25.2g NaHCO3溶于蒸馏水中, 用NaOH将pH调至9.5, 加水至3升。
(d). 0.1M NaCO3(pH9.5): 1.5升(c)溶液中加入1.5升蒸馏水。
(e). 肝素/NaHCO3: 0.5g肝素(钠盐)溶于(c)溶液100ml中。肝素的分子量和组成因来源不同而变化。来自猪小肠粘液的肝素(钠盐)(Sigma)在上述方法中使用可使结果准确可靠。
(f). 0.1M醋酸钠酸缓冲液(pH4.0): 16.40g醋酸钠溶于蒸馏水、用乙酸将pH调至4.0, 加蒸馏水至体积2升。
(g). 2.0M 尿素: 240g尿素溶于蒸馏水, 总体积为2升。
(h). 2M NaCl: 116.9g NaCl溶于蒸馏水, 使总体积为2升。
(i). 5mM Tris-HCl/0.05M NaCl/0.03M 乙基汞硫代水杨酸钠(pH7.4): 0.2g 乙基汞硫代水杨酸钠溶于2升5mM Tris-HCl/0.05M NaCl混合溶液中。
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方案5: 肝素-葡聚糖凝胶的制备
制备过程应在通风好和有防烟罩的房间中进行, 因为CNBr会释放有毒和有剌激性的氰化物浓烟。
(1). 用蒸馏水将包装体积50ml的葡聚糖凝胶4B (Pharmacia/LKB)稀释至100ml。
(2). 边搅拌边缓慢加入100ml(a)溶液(2M Na2CO3)。
(3). 浆状物中一次性加入5ml冰冷的(b)溶液, 用力搅抖2分钟。
(4). 将浆状物倒入多孔砂芯玻璃漏斗, 用1升(d)溶液洗涤, 然后用1升蒸馏水, 最后用1升(c)溶液冼涤, 真空过滤以形成湿结块。
(5). 将此原料转入含100ml(e)溶液的塑料瓶内, 混匀后4℃下放置20小时。
(6). 加入7.5g 甘氨酸以封闭所有非偶联的反应基团, 混匀在4℃下置放18小时。
(7). 在粗砂芯玻璃滤器中, 用下列溶液各2升依次连续冲洗肝素-葡聚糖凝胶:(f)溶液、(g)溶液、(d)溶液、(h)溶液、(i)溶液。
(8). 真空过滤以形成湿结块。将其移入密闭容器, 加入等体积(i)溶液, 终产物在4℃下至少保持6个月稳定不变。
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(三)、层析
1. 试剂
(a). 5mM Tris-HCl/0.05M NaCl(pH7.4): 1.83g Tris和8.76g NaCl溶于蒸馏水, 用盐酸将pH调至7.4, 加水至3 升。
(b). 5mM Tris-HCl/0.05M NaCl/0.025M MnCl2(pH7.4): 0.61g Tris和2.92gNaCl 溶于蒸馏水, 用HCl将pH调至7.4, 加水至1升, 再加入4.95g MnCl2(用前加入, 因长时间放置后MnCl2会沉淀)。
(c). 5 mM Tris-HCl/0.1M NaCl (pH7.4): 0.61g Tris和5.84g NaCl溶于蒸馏水, 用HCl调pH至7.4, 加水至1升。
(d). 5mM Tris-HCl/0.6M NaCl(pH7.4): 0.61g Tris和35.1g NaCl溶于蒸馏水, 用HCl调pH至7.4, 加水至1升。
2. 样本制备
(a). HDL样本(1.063-1.210g/ml密度范围内经超速离心制备)用50倍体积的(a)溶液透析, 4℃下搅拌至少18小时, 并换缓冲液数次。
(b). 加适量(a)缓冲液, 将浓度调至HDL蛋白量为4-8mg/ml。
(c). 上柱前在HDL溶液中加入固体MnCl2, 使Mn攩++攪终浓度为25mM(如每ml加5.0mg MnCl2)。
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方案6: 肝素-葡聚糖凝胶亲合层析分离富含Apo E和少含Apo E的HDL
(1). 搅拌肝素-葡聚糖凝胶浆状物, 静置数分钟后弃去上层清液以清除微细颗粒, 加入等量(a)溶液, 再搅拌以去除气体。
(2). 浆状物装柱(12cm x 1.0cm内径), 最好用可调节容量的接头, 以去除柱顶的死腔。
(3). 在4℃下完成余下的操作程序, 让(a)缓冲液以12-15ml/hr的流速过柱至少18小时, 以确保其达到平衡。
(4). 上样前即刻让20-30ml(b)液过柱。
(5). 将1.5ml HDL溶液(其中已加入MnCl2)上柱, 用2-3ml(b)溶液将HDL洗入柱内并放置过夜, 使其充分结合。
(6). 层析柱和记录仪与分部收集器相连, 用(b)缓冲液洗脱非结合蛋白(I部分)直到280nm 处的吸收值回到基线(约20ml), 收集4ml洗出物。
(7). 用(c)缓冲液代替冼脱液─(b)溶液, 用此缓冲液继续洗脱直到结合的HDL(II部分)完全从柱上洗出。
(8). 最后用(d)缓冲液洗脱, 收集第III部分。
(9). 用至少30ml缓冲液过柱使其平衡, 为下一次层析分离作准备。
(10). 若需要定量的结果, 可用紫外分光光度计在280nm处测定各部分的吸收值。
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典型的洗脱结果是: I部分(非结合HDL)以含无Apo E的HDL亚类为主, 大多属于HDL3亚类, 但也含有某些HDL2成份。II部分(结合的HDL)内为富含Apo E的HDL亚类, 这些主要由大颗粒HDL组成, 它们属于HDL2亚类。III部分含少量LDL和Lp(a)。含I部分和II部分的各分部冼脱成份可以收集并浓缩, 用于进一步的分析或代谢研究。搅拌池(Amicon, Sartorius)或诸如Centriprep及Centrisart I(Amicon, Sartotius)的离心浓缩管非常适合此目的。
I部分和II部分的各分部中A280值相加, 即可得出血中不含和富含Apo E的HDL 浓度, 这是用一个转换系数(0.41mg HDL-蛋白/一单位A280)计算出来的。该方法重复性好, 两年间对同一受试者进行5次富含Apo E的HDL浓度测定, 其变异系数为9.5%。
三、免疫亲合层析
(一)、原理
免疫亲合层析为HDL亚群的分离提供了一个相当有力的工具, 因为它是少数几种不用高浓度盐酸进行超速离心的方法之一。经此处理后, 一些载脂蛋白会从自然状态HDL颗粒中明显分离出来, 血浆与固定的单一特异抗体混合, 洗涤除去非结合的及非特异结合的蛋白和脂蛋白后, 用适当的溶剂将含特异载脂蛋白抗原的脂蛋白类混合物分离出来。这种方法用于分离含有Apo AI和Apo AII的HDL颗粒与仅含Apo AI而不含Apo AII颗粒的分离。这一技术可获得有关含特异载脂蛋白的HDL亚类的物理特征及代谢作用方面的有用信息。这一方法的几种形式已被成功地采用, 其中包括下面将要介绍的含Apo AI及Apo AII的HDL分离操作。必须强调的是, 由于不同抗体的亲合性及其他特征不同, 因而结合与洗脱的条件应随制备抗体的变化而变化。
(二)、 一般方法
1. 试剂
(a). 0.2M磷酸钠/0.5M NaCl(pH6.8)
i). 31.2g NaH2PO4·2H2O溶于蒸馏水, 加水至1升。
ii) 71.6g NaH2PO4·12H2O溶于蒸馏水, 加水至1 升。
51份i)液与49份ii)液混合, 使pH达6.8, 每升溶液加NaCl 29.2g。
(b). 0.01M Tris-HCl/0.15M NaCl/1mM EDTA/0.02%硫汞(pH7.4): 1.21gTris溶于蒸馏水, 用HCl调pH至7.4, 加8.77g NaCl, 0.37g Na2EDTA, 0.2g 硫柳汞, 加水至1升。
(c). 0.1M NaHCO3/0.5M NaCl/1mM EDTA(pH8.0): 8.40g NaHCO3溶于蒸馏水,pH调至8.0, 加29.2g NaCl和0.37g Na2EDTA, 加水至1 升。
(d). 0.5M 乙酸/0.5M NaCl/ 1mM EDTA(pH3.0): 29.2g NaCl, 0.37gNa2EDTA溶于0.5M 乙酸, 使其体积达1 升。
(e). 3M硫氰化钠: 24.3g NaSCN溶于蒸馏水, 终体积1升。
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方案7: 免疫亲合层析的一般方法
(1). Apo AI和Apo AII的特异单抗体在(a)液中按每毫升凝胶7-8mg免疫球蛋白的比例与葡聚糖凝胶4B交联。
(2). 免疫吸附剂在4℃(a)缓冲液中存放, 直到用时取出。
(3). 将1ml血浆与2ml免疫吸附剂在4℃下混合1小时, 所需免疫吸附剂的量由其结合能力决定, 这最好在预实验中测得。
(4). 将HDL-免疫吸附剂的混合物装入内径约1.5cm的硼硅酸盐柱。
(5). 用(b)缓冲液将非连结蛋白从柱上洗出。
(6). 用(c)液洗出非特异结合蛋白。
(7). 最后用(d)液(立即在其中加入固体Tris以缓冲溶液)或(e)液洗脱含Apo AI或含Apo AII的脂蛋白颗粒。两种洗脱液的HDL回收都很高。据报道, 用乙酸洗脱时, 卵磷脂:胆固醇酰基转移酶的回收更高, 但胆固醇酯转移活性只有用硫氰根作去吸附剂才能检出。
(8). 将洗出样本浓缩到适当体积备用。
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(三)、含Apo AI及Apo AII脂蛋白分离
新鲜血浆与抗Apo AII免疫吸附剂在4℃孵育1小时, 装入一小硼硅酸盐柱, 最后依次从柱上冼出非结合蛋白, 非特异结合蛋白及含Apo AII的脂蛋白, 方法详见上文。
(四)、含Apo AI不含Apo AII脂蛋白分离
将上述获得的非结合血浆蛋白与抗Apo AI免疫吸附剂4℃孵育1 小时。按上法依次洗出非结合蛋白、非特异结合蛋白及含Apo AI而不含Apo AII的脂蛋白。
四、分离HDL亚类的其他方法
凝胶滤过层析可用来分离出足量的HDL亚类, 以供其成份测定。此方法的分辨力不足以将HDL亚类分离成不连续带, 因而HDL被洗成单一的宽带。但是, 洗脱液 中基本上含 HDL2b、HDL2a、HDL3a及HDL3b亚类, 这可用梯度胶电泳来鉴定。
尽管吸附层析的方法应用不广泛, 但应用羟基磷灰石与其他方法结合后至少能成功地应用于分离成份不同的HDL亚类。此方法先将超速离心制备的HDL(HDL2或HDL3)加到含羟基磷灰石的层析桩上, 然后逐步加入浓度范围0.05M-0.65M磷酸钾(pH6.8)缓冲液进行洗脱。
Pevikon阻滞电泳已被用于HDLc的分离。HDLc是一种富含Apo E的HDL亚类, 它见于用胆固醇饲养的几种动物体内, 并可能与人类HDL1相似。该方法包括先在有Pevikon珠作支持基质的平背床上将HDLc从其他脂蛋白类中电泳分离, 随后将此成份从其移入的床容积区洗脱出来。