第五节 LDL亚类分离
应用密度梯度超速离心技术可将LDL分离成几个亚类, 已有多种方法报道, 这些方法在梯度组成和得到的LDL亚类外观上有相当大的差别。但没有任何一种方法被认为是通用的。现将几种分离效果较满意的方法作一简介。具体采用的方法应由超速离心的范围及研究者备有的水平转子类型来决定。为了获得可靠的且重复性好的结果, 需要有高质量的密度构建仪和梯度成份收集方法。
用梯度凝胶电泳法可对LDL分离亚类进行特征鉴定。但该方法本身没有定量测定LDL亚类浓度的分辨力。因而将两种方法联用对全面估计可靠的LDL亚类分布是可取的。
一、密度梯度超速离心
(一)、Krauss和Burke的方法
这是用于LDL亚类分离最早介绍的密度梯度法, 并在诸多方面形成后来方法的基础。此分离技术可得到四种密度亚类, 分别称为LDL1, LDL2, LDL3, LDL4, 详见方案13。
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方案13: 用Krauss和Burker法进行LDL亚类的密度梯度超速离心分离。
(1). 方案1的改良法, 通过密度1.019-1.063g/ml的超速离心将LDL从血浆中分离出来。
(2). 用密度1.0400g/ml的NaBr溶液透析过夜, 换液2次。
(3). 在一9/16"×3"的Beckman polyallomer(同质异晶聚合物)管(超净离心管)内小心将2ml已透析过的LDL覆于2.5ml密度为1.0540g/ml的NaBr溶液之上, 再将2.5ml密度为1.0275g/ml的NaBr溶液覆于LDL液之上。
(4). 22-24℃, Beckman SW41转子, 40000rpm离心40小时。
(5). 回收管内容物, 首先是顶层的0.5ml, 然后分6次, 每次收集1ml成份, 最后收集管底的0.5ml。
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(二)、Chapman等人的方法
本方法采用更为完备和更广的密度梯度范围, 它将LDL分离成八个或更多的部分, 各部分电泳迁移率、分析性超速离心的漂浮率、颗粒大小、类脂及载脂蛋白组成等均不相等。
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方案14: Chapman法密度梯度分离LDL亚类
(1). 用密度1.019—1.063g/ml范围的超速离心将LDL从血浆中分离出来,然后用密度1.040g/ml的NaBr溶液透析。
(2). 用带蠕动泵的自动密度流仪II(Auto—DensiflowII)(Buchler仪器公司)或相当的密度梯度构建仪将4.5ml密度1.054g/ml的NaCl—KBr溶液泵入一9/16"×3"的Beckman超净离心管管底(管容积为13.2ml)。然后将下列各溶液依次覆于其上。
* 3.5ml含15mg蛋白的透析过的LDL溶液
* 2.0ml密度1.024g/ml的NaCl-NaBr溶液
* 2.0ml密度1.019g/ml的NaCl溶液
(3). 15℃下用Beckman SW41转子, 40000rpm离心44小时。
(4).用密度梯度分馏器(185型,ISCO)通过管底钻孔用不相容的密度液(如Fluorinert FC40;ISCO)向上移位分馏梯度液。先用成分收集器收集0.84ml, 然后收集15份, 每份0.8ml。
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(三)、Griffin等人的方法
该法可在24小时内直接从血浆中分离出LDL亚类, 且可能是目前首选的方法。它将LDL分为三个亚类: LDL1、LDL2和LDL3, 它们的浓度在男性、女性及冠心病病人中各不相同。该方法的优点在于它直接分离新鲜血浆, 因为LDL亚类在长时间的离心过程中易变得不稳定。该方法分离出的亚类与Krauss和Burke法所确定的相同。步骤见方案15。
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方案15: Griffin法密度梯度分离LDL亚群
(1). 将血样本收集到EDTA溶液(1mg/ml)管中, 通过加入固态KBr(0.38g/3ml血浆)将分离血浆密度调至1.09g/ml。
(2). 将下列溶液用蠕动泵依次加入聚乙烯醇涂层的Polyallomer(同质异晶聚合物)SW-40(9/16"×3 3/4")Beckman管中。
* 0.5ml密度梯度1.182g/ml的KBr溶液
* 3.0ml透析过的LDL溶液(密度1.09g/ml)
* 1.0ml密度1.060g/ml的KBr溶液
* 1.0ml密度1.056g/ml的KBr溶液
* 1.0ml密度1.045g/ml的KBr溶液
* 2.0ml密度1.034g/ml的KBr溶液
* 2.0ml密度1.024g/ml的KBr溶液
* 1.0ml密度1.019g/ml的KBr溶液
(3). 用4分钟以上的时间将Beckman48-60超速离心机的转子加速到170r.p.m。然后40000rpm离心24小时,无闸停转。
(4). 在血浆层以下以0.69ml/min的流速注入稠密的疏水物质(如Maxidens,1.9g/ml,Nycomed Ltd)向上移位取代含分离LDL成份的梯度液, 并用A280持续监测洗出液。 (5). 测量管中已被密度1.09g/ml NaBr溶液取代的血浆梯度。
(6). 通过出现在密度间区: 1.025-1.034g/ml(LDL1), 1.034-1.044g/ml(LDL2)和1.044-1.060g/ml(LDL3)的最大峰值来确定LDL的主要亚类。而次要亚类可通过吸收曲线的独特峰和肩状突出来识别。
(7). 将LDL总浓度按各吸收峰面积的比例计算单个LDL亚类的浓度。需先按特定的消光系数(LDL1: 1光密度单位=2.63mg脂蛋白1/ml; LDL2: 1光密度单位=2.94mg/ml; LDL3: 1光密度单位=1.92mg/ml)将吸收单位转换为脂蛋白总当量。
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(四)、Swinkels等的单旋梯度超速离心法
本方法通过密度梯度的条带状分离, 可清晰地认别两个LDL亚类, 即较轻的LDL1带(偶尔呈现两条细分的带)和较重的LDL2带。所分离亚类的颗粒大小及化学组成各不相同。它提供了一个从小量血清中鉴别和分离LDL亚类的简捷方法。
二、梯度胶电泳分析LDL亚群
LDL或其亚类的样本的电泳、染色及扫描方法同HDL亚类分析中所述(见前),只是用2-16%聚丙烯酰胺梯度凝胶(Pharmacia)代替4-30%的凝胶。