脂蛋白体内代谢测试

   血浆胆固醇和甘油三酯动力学的早期研究是采用标记前体[³H]甘油, [¹⁴C]脂肪酸)为基础。此标记前体将被结合到血浆类脂部分. 测定它们在血循环中的清除量可得到全身代谢率的初步原始资料。但当人们认识到血流中的类脂可与特异的蛋白结合（如类脂－蛋白复合物式脂蛋白），且在不同类脂蛋白之间此类特异蛋白可互相交换, 这种方法的局限性是显而易见的。因而最近大多数代谢研究都已采用外源性标记方法,该方法是将研究的脂蛋白或载脂蛋白分离并通常用碘作示踪标记。示踪剂然后被注入受试者体内, 定时抽取血样以了解其分解代谢情况。血浆中与特异脂蛋白成份结合的蛋白的放射活性消失速度可用来估计蛋白的分解代谢速率(FCR), 表示方式为"分解代谢池/每日"。血浆池测定本身(mg为单位)可用来计算蛋白的绝对分解代谢率(mg/日为单位), 它通常以每公斤体重表示。在稳态条件下,分解代谢率与脂蛋白中载脂蛋白的合成速度相等。在早期研究中, 此方法首次用于脂蛋白分析,但大多数目前的工作是首次分离出特定的脂蛋白类(LDL)并测定其蛋白成份(Apo B)的合成及分解代谢率。

    外源性标记技术的正确性是基于以下假设:

    (a)标记过程不改变所研究脂蛋白的结构, 也就是说示踪物与被示踪物为等量代谢。

    (b)示踪物具有结构及代谢的同源性。

    (c)分解代谢发生在或接近于血浆池内, 还可发生在与血浆快速平衡的池内。

    (d)被示踪的血浆蛋白浓度(池)在研究期间不会发生改变, 也就是说没有长时间的及短期的节律变化。

    而且用于分析蛋白放射活性值的方法可明显地影响最后结果的判断。已有许多数学处理方法, 包括曲线剥离(curve peeling), 回归分析(deconvolutio)模拟相互作用(interactive simulation) 及多室模型。最初由Berman用于脂蛋白系统的多室模型应用最为广泛, 它被作为检验研究系统定量假说的工具。用标记的氨基酸前体研究载脂蛋白动力学还没成为一种广泛应用的技术,因为人们不愿为了得到有意义的结果而使用大剂量的[¹⁴C]。Fisher提供了有关[¹⁴C]亮氨酸掺入含脂蛋白的Apo B中的资料, 而Eaton等使用的是[⁷⁵Se]硒蛋白酸。假如能准确估计直接前体氨基酸池(通常为肝池), 则可直接由标记的前体测量合成速率。示踪物类的再循环常常限制了此方法在快速代谢脂蛋白类(象LDL)中的应用。假如研究LDL和HDL, 需使用复杂计算机模型, 因它解决了标记氨基酸再利用的问题。稳定同位素检测系统的新发展使应用富含无放射活性[¹³C]或[¹⁵N]的氨基酸测定合成速率成为可能。此项技术的早期应用结果很令人鼓舞, 它与用放射性碘示踪物测得的数值很相似。与使用放射性内源前体的方法一样, 它也受到再循环问题的干扰, 它所提供的信息应被视为对外源性标记示踪物结果的补充, 很难使稳定同位素技术完全取代后者。

    下面将详细叙述研究脂蛋白、载脂蛋白动力学的各种方案。因为用于各种脂蛋白类的具体操作稍有不同, 所以它们将逐一被介绍。

第一节  体内代谢测试方案

    一、LDL代谢

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    方案1: LDL分离

    (1). 禁食14小时后抽取受试者血浆50ml。

    (2). 用Patsch等人的区带超速离心法制备LDL(d为1.030-1.050g/ml), 或在上述密度范围内(1.030-1.050g/ml)用密度梯度离心法制备。

    (3). 用0.15M NaCl/0.01%Na EDTA(pH7.0)透析清除盐类。必要时用XM100A纤维素膜(Amicon)过滤将脂蛋白成份浓缩到蛋白浓度为3-5mg/ml(按Lowry等人的方法测定)。

    放射性标记按Mc Farlane的一氯碘法进行, 此法由Shepherd等人改进。

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    方案2: LDL标记

    (1). 制备下述碘化混合物: 将1.0ml LDL溶液同0.5ml 1.0M甘氨酸(pH10)及2.0MCi的不含载体的Na125I(或Na131I)混合。

    (2). 加入适量一氯化碘溶液(25mM于1.0M NaCl中),使ICl与蛋白比例大约为20mol:500,000道尔顿(Da)蛋白。轻轻混合(这