脂蛋白受体相互作用测试
人体内的血浆脂蛋白主要是经受体途径进行分解代谢。在这一过程中细胞膜表面脂蛋白受体的结构和功能对脂蛋白的代谢起着关键性的作用。
第一节 细胞培养
一、细胞系和株
培养基中生长的细胞表达不同程度的LDL受体。所以有可能用于细胞表面LDL受体结合分析。培养的纤维母细胞, 平滑肌细胞, 中国仓鼠卵巢细胞和肝细胞系应用最广。在受体结合试验之前5-7天, 将细胞从培养瓶中转移到各独立孔中代传培养, 其目的在于在实验时获取近于汇合(confluence)的培养细胞。实验用的代传培养法详见方案1。
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方案1: 代传培养细胞的方法
(1). 从培养瓶中移取培养基, 每个T75瓶用约2ml的胰蛋白酶/EDTA洗涤单层细胞一次(0.05%胰蛋白酶, 0.53mM EDTA, 0.22um滤膜过滤, 分装, 4℃下保存一月或-20℃下保存至使用)。
(2). 从瓶中吸出胰蛋白酶洗液, 另加入3-4ml胰蛋白酶, 将培养瓶放置水平位。
(3). 当瓶中细胞开始集拢(但未分开)(1-3分钟),立即将胰蛋白酶抽出并用力敲击瓶壁将细胞移开; 若在胰蛋白酶抽出前细胞已开始分离, 敲击瓶壁将细胞移开, 加入含10%血清的培养基, 将所有培养基(包括细胞)移入一无菌离心管内, 1000rpm离心10分钟, 将细胞中的培养基吸出。
(4). 细胞中加入10ml温热(37℃)的含血清培养基。可用Dulbecco’s的改良的Eagle’s培养基(DMEM), 它含10%牛血清(FBS), 它可作多数成纤维细胞和平滑肌细胞系的培养液。用吸管反复吸冲使细胞完全悬浮, 用Coulter计数器或血细胞计数仪计数一份细胞悬液的细胞数。
(5). 将细胞悬液按表3-41-1稀释, 准备平皿接种。必须要求细胞悬液均匀, 在平皿接种过程中不断混合瓶中内容物即可确保这一点。将悬液以移液器定量加入每孔。将培养皿前后(不要旋转)及对角方向轻摇数次, 确保细胞在孔中分离均匀。[组皿(Cluster dishes)(Falcon Labware)在同一板上有多个孔,可较大程度地加速传代培养和受体结合试验, 有24×16mm, 12×22mm或6×35mm几种规格可供使用。
表3-41-1. 用于传代培养的代表性细胞数目a
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细胞系 皿的大小、直径(mm) 每孔细胞悬液体积(ml) 细胞/孔b─────────────────────────────
人类成纤维细胞 16 1 9X103
22 1 14X103
35 2 34X103
60 3 60X103
100 5 150X103
狗平滑肌细胞 22 1 12X103
35 2 30X103
60 3 50X103
巨噬细胞/板
鼠腹膜巨噬细胞 16 1 4X105
22 1 1X106
35 2 2-3X106
60 3 5X106
100 5 10X106
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a. 所需细胞数应由细胞生长的不同来调节, 此表可作为初步实验的估计值。
b. 本表所用的是7天生长期。生长期更短时, 每少一天另加1/3的细胞数。
(6). 细胞传代培养的另一个方法是以分裂比为基础而不是采用细胞计数, 此法可用来保留原种培养瓶。例如:在一个T75培养瓶中生长面积是75cm2, 而在35mm皿或孔中的生长面积是9.6cm2, 它们之间的比值是7.8。因此大约8个35mm皿的面积等于一个T75瓶面积。以人类成纤维细胞分裂比为1:4计, 一个T75合种瓶在一周内的产量约等于35mm合种皿的32倍。当首次制定出细胞系或株的生长条件时,这一方法对平皿接种细胞非常有用。
(7). 将细胞置7%CO2培养箱中生长5-7天, 试验前24-48小时, 将培养基换成含10%无脂蛋白血清(LPDS)的DMEM, 以上调LDL受体表达。加含10%LPDS培养基之前以含5%LPDS的培养基洗涤细胞一次。在每一皿的底部为各孔编号。
(8). 在实验当天, 细胞应有约90-95%汇合, 在培养皿表面均匀分布。
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二、小鼠腹膜巨噬细胞
小鼠腹膜巨噬细胞可采用改良的Cohn和Beason方法获得, 多用雌性Swiss/Webster
小鼠。
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方案2: 获取小鼠腹膜巨噬细胞方法
(1). 在一个密闭的广口瓶内用2-3ml Metofane(甲氧基氟烷,Pitman-Moore)一次麻醉四只小鼠。
(2). 脱颈处死小鼠, 将它们背朝下放置, 用95%EtOH冲洗腹部, 用镊子将腹部皮肤提起使其与腹膜分开, 再剪开皮肤, 插入剪刀使切口扩大, 并展开皮肤。
(3). 用带20-22号针头的12cc注射器将8-10ml灭菌磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)注入腹腔。轻摇小鼠振动腹膜, 将小鼠侧放用无菌注射器和针头抽取腹腔液体(含有腹膜上的巨噬细胞), 将几只小鼠的腹膜液汇集到放置于冰上的50ml灭菌试管中。弃去带血或变色的液体。(变色液体表明有可能有肠漏)。
(4). 在4℃下200g离心15分钟, 使细胞完全悬浮于5-10ml DMEM中, 在Conlter计数器上计数细胞, 并使用Channelyzer(Conlter Electronics)使细胞群可见。腹膜渗出液中会含有血小板、红血球、大的淋巴细胞及占多数的巨噬细胞群。按细胞数及样本中巨噬细胞所占的实际比率进行最后稀释。通常每只小鼠可获1-3×106个巨噬细胞。
(5). 按表6-7吸取细胞悬液, 将平皿前后及对角方向轻摇数次, 使细胞在各孔中分布均匀。在37℃下在7%CO2孵育箱内将培养皿孵育1-1.5小时, 让巨噬细胞贴壁。
(6). 用DMEM洗三次, 洗出未粘附的细胞, 每次洗涤时轻摇各孔。加入含10%PBS的DMEM孵育过夜。第二天或在用前轻摇, 用含10%PBS的DMEM洗涤细胞一次。
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三、人类单核-巨噬细胞
从血中分离的人类单核细胞培养7天可分化成巨噬细胞 。
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方案3: 获取人类单核-巨噬细胞方法
(1). 将血液收集到柠檬酸右旋糖(ACD)中; 每50ml血加9ml ACD。
(2). 转入无菌的50ml锥形管, 在4℃下500g离心35分钟。
(3). 吸出血浆, 收集位于血浆与红细胞之间的淡黄色白细胞层。
(4). 每50ml管中加20ml细胞悬液, 加15ml PBS,再用长的腰穿针按Boyum介绍的方法在管底层加15ml Ficoll-Hypaque(Falcon Labware)分离培养基(d=1.077-1.080g/ml)。
以400g在室温下离心45分钟(不用制动闸)。
(5). 也可将全血用PBS 1:1稀释, 将它直接覆于Ficoll-Hypaque上(或将Ficoll-Hypaque注于其下)。这一作法往往可使血细胞回收增加, 但它也引起较高比例的红细胞和血小板混杂。
(6). 吸出大部分上层PBS。收集Ficoll-Hypaque和PBS界面的白细胞层。用5倍体积的PBS稀释白细胞, 再低速离心沉淀细胞(300g, 4℃, 35分钟)。
(7). 尽可能移出全部上层清液, 用40ml PBS中再悬浮细胞。在4℃下200g离心10分钟沉淀细胞。再重复一次。
(8). 反复吸冲使细胞悬浮于10ml DMEM中, 取出一份在Conlter计数器上进行细胞计数, 用Channelyzer计算单核细胞百分比。
(9). 用DMEM稀释到所需浓度, 按表6-7进行平皿接种细胞。
(10). 在7%CO2培养箱中用37℃孵育1-1.5小时后, 用DMEM洗涤细胞三次, 轻摇移去未粘附细胞, 用含10-20%自体人血清的DMEM培养约7天, 并第3天加用新鲜培养基。
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