第二节 受体结合分析
一、直接的细胞表面受体结合
在4℃下脂蛋白与LDL受体结合, 但脂蛋白受体复合物尚未内在化(internalized),
脂蛋白与LDL受体处于平衡状态,因而可进行平衡结合研究。此项研究的数据可用Scatchard分析来测定脂蛋白与LDL受体的亲合力及每个细胞受体结合脂蛋白的量。所用脂蛋白浓度取决于平衡解离常数(Kd), 应采用大致与Kd数值相等的浓度。以下是常用的放射标记脂蛋白浓度范围: 人类LDL, 0.25-12ug/ml; 人类III型β-极低密度脂蛋白(β-VLDL), 0.2-10ug/ml; 狗Apo E HDLC, 0.01-1.2ug/ml; 狗β-VLDL,0.54-4ug/ml; 及Apo E-双十二酰磷酸胆碱(DMPC)复合物, 0.005-1.0ug/ml。(所有浓度基于Lowry等人的蛋白测定法)
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方案4: 用于研究125I-标记脂蛋白与完整细胞表面LDL受体平衡结合的方法
(1). 实验前, 将带细胞的培养皿置一大盒冰上的金属托盘上预冷10-15分钟。
(2). 在15ml塑料锥形管内制备并在冰上预冷15分钟后的脂蛋白溶液组成是:DMEM-Hepes-LPDS[N-2羟乙基哌嗪-N'-2磺酸乙烷(Hepes), (代替重碳酸盐)pH7.4缓冲的DMEM, 含10%LPDS]。它含有为双份培养皿准备的6-12种不同浓度的125I-标记脂蛋白。每种浓度的125-I标记脂蛋白的第三块培养皿内的溶液通过加入20-100倍过量非标记配体来测定非特异结合。
(3). 当细胞培养皿在冰上时, 弃去细胞培养基, 用含放射标记脂蛋白的培养基替代。可采用在16mm皿内加0.25ml, 22mm皿内加0.45ml, 35mm皿内加0.95ml, 60mm皿内加1.9ml。从每管中取两份(每份20ul)测放射活性, 他们用于Scatchard分析法的计算及确定有放射活性脂蛋白的浓度。在冰上孵育并轻摇冷浴中的细胞3-5小时。(4℃下多数脂蛋白的受体结合在5-6小时内达到平衡, 但对多数情况而言, 孵育3-4小时足
以达到平衡)。
(4). 孵育终止时, 仍置细胞于冰上,弃去培养基,用冷的PBS-BSA(每mlPBS含2mg BSA)洗涤单层细胞三次。继之用相同缓冲液孵育10分钟, 并用冷PBS快速洗涤, 先后重复两次。洗涤细胞时, 用与重复分配器相连的长管进行。洗涤液沿孔壁流下, 覆盖所用细胞。细胞与培养皿的附着力差别很大, 所以对一些培养物必须十分小心。
(5). 将细胞从冰上移开, 用重复分配器(加样器)在每孔中加入0.1M NaOH 0.5ml, 用手轻摇平皿, 以确保整个平皿都被NaOH覆盖。封盖, 在室温下孵育10分钟使细胞溶解。
(6). 将已溶细胞移入12×75mm管内, 用0.5ml NaOH洗各孔一次, 将洗液倒入管内。 (7). 塞好试管, 在r-计数仪上进行125I计数。现在多数计数器可进行重复实验平均取值, 消除背景以及计算100%对照的百分比, 这可节省手工计算的时间。
(8). 在测定蛋白浓度之前将试管置4℃保存, 可使用根据Technicon Lowry方案设计的Technicon自动分析II型仪, 用BSA作标准。此自动分析仪直接从12×75mm原管中自动取样。当采用的是单层细胞且属接触抑制(如成纤维细胞)或为接近汇合时,每孔中的细胞蛋白几乎完全一样, 因而只需进行抽样测定。但当使用非接触抑制细胞(如平滑肌细胞)或在培养中有不分化的细胞(如巨噬细胞)时, 因各孔之间变化大而需逐管分析。
(一)、Scatchard分析
平衡结合研究得来的数据可通过Scatchard分析进行线性化。根据这一分析可确定125I-标记配基与受体结合的亲合力常数(Kd)和受体饱和时受体结合脂蛋白的数量。通过在X轴上标出"毫微克结合量(B)及在Y轴上标绘结合/游离比(B/F),如果在平衡时配基与受体均为纯体, 并且呈简单的双分子反应(如LDL与LDL受体的平衡结合), 那么就可得到一条直线。现有一种用于称为Scatdata的IBMPC的相互作用的BASIC程序, 它可将直接结合试验的原始c.p.m数据转化为Scatchard坐标系, 通过线性回归计算出常数、最大结合量以及相关系数。
假如B对B/F作图所得显然不是一条直线, 那么配体-受体结合的分析就更为复杂。在这种情况下,可能脂蛋白存在不均一性, 或存在一种以上的受体(或其他结合位点)。不幸的是象Scatchard坐标一类的简单图解不适合分析复合恒温线。
(二)、竞争性结合分析
在竞性结合试验中, 未标记的与125I-标记的脂蛋白竞争性结合细胞表面的LDL受体。本方法与方案4所列的直接结合试验相似, 只有以下几点差异:
(1). 冰上孵育只进行2小时。
(2). 125I-标记脂蛋白浓度不变与其Kd值相近, 而未标记的竞争配体浓度递增。未标记脂蛋白浓度应在小于标记脂蛋白Kd值及大于或等于20倍Kd值之间。
(3). 每种浓度的竞争物应设有22孔, 同样也应设有含125I标记脂蛋白的而不是未标记脂蛋白(100%对照)的双孔。含有125I-标记脂蛋白及100倍过量未标记脂蛋白的孔被用来测定125I-标记脂蛋白的非特异结合。应常规用100%及非特异结合对照的四个复判孔。实验开始及结束时分别设2个, 以帮助校正任何系统误差。
(4). 竞争物的5%竞争点(抑制125I-标记脂蛋白结合5%时所需的脂蛋白浓度)可通过如下数学方法确定:将竞争物的浓度(ug/ml)转化为对数值, 将百分比结合值转化为概率单位。概率单位转化可根据发表的表格进行手工计算。几种统计学计算机图表程序也可进行概率单位转换(Plotit, 科学程序公司, Sigma Plot,JandelScientific)。 以概率转换的结合百分比数据为Y轴及以浓度对数为X轴.得到一条直线,通过线性回归可确定50%值。上述计算机图表程序具有可转换、制图及确定和打印50%值的优点。
(三)、用抗体进行受体结合研究的分析法
特异的多克隆和单克隆抗体是研究脂蛋白受体相互作用的有力工具。特异多克隆抗体被用来证实小鼠腹膜巨噬细胞上特有的通过LDL受体介导β-VLDL摄取, 同时证实加入外源性Apo E后β-VLDL能与LDL受体相关蛋白结合。单克隆抗体被用来描绘Apo B100及Apo E的受体结合域以及确定脂蛋白中哪种载脂蛋白与受体结合。这类研究中所用的抗体必须是高亲合力抗体,它与载脂蛋白或受体的亲合力必须大于或等于脂蛋白与受体的亲合力。
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方案5: 用抗体进行结合研究的方法
(1). 用于受体结合测定的抗体必须是纯化的IgG或Fab片断,因为即使在抗血清或腹水中的少量内源性脂蛋白都可能与125I-标记的脂蛋白竞争, 造成假阳性结果。由于巨噬细胞具有Fc受体, 在研究巨噬细胞培养物的抗体时应采用Fab片断代替IgG。
(2). 若抗体是针对载脂蛋白的, 将抗体与125I-标记脂蛋白在DMEM-Hepes-LPDS中混合, 室温孵育1小时, 冷却溶液, 按方案4所述将其加至预冷的细胞上。 (3). 若抗体是针对受体设计的, 用DMEM-Hepes-LPDS将抗体稀释至要求的浓度, 在冰上冷溶液中与细胞一起预孵育1小时。备好10倍浓缩的125I-标记脂蛋白的DMEM -Hepes-LPDS溶液, 将其直接加入平皿, 在冰上再孵育2-3小时。例如, 要制备1ml培养基中125I-标记LDL终浓度为2ug/ml的溶液, 则加900ul含抗体培养基进行1小时预孵育, 随后加入100ul 20ug/ml的125I标记LDL溶液。
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二、结合、内在化(internalization)及降解分析
125I-标记脂蛋白与培养细胞在37℃一起孵育时, 脂蛋白被受体结合、内在化并在溶酶体内降解。125I-标记载脂蛋白降解为小分子多肽和氨基酸, 混匿于培养基之中。大约在37℃下2小时后达到稳定状态, 结合于受体上及含于细胞内的125I-标记脂蛋白的量固定不变。但随孵育时间延长, 培养基中的降解产物持续增长。可采用较长的孵育时间, 通常用5小时或16小时(过夜)孵育。 37℃下试验与4℃下试验(见方案4)相似,但有以下不同:
(1). 脂蛋白与LDL受体的外显结合常数在37℃较高,因而应采用较高浓度的脂蛋白。
(2). 孵育在37℃ 7%CO2培养箱内进行, 所以培养基内不含Hepes,而用含DMEM的NaHCO3缓冲液。
(3). 脂蛋白与培养基必须避免细菌污染, 尤其是过夜孵育更应注意。使用灭菌的DMEM-LPDS, 并用预冲洗过的带醋酸纤维膜(0.45um用于LDL和HDLc, 0.8um用于VLDL和β-VLDL)的注射过滤器滤过脂蛋白贮存液。
(4). 在加入细胞之前, 含脂蛋白的培养基应达到或接近37℃。
(5). 孵育之后, 将细胞置冰上的金属盘中冷却。孵育培养基移出并留作降解分析用(方案7), 洗涤细胞(方案4)。
(一)、结合脂蛋白的释放
在37℃下与125I-标记脂蛋白一起进行孵育的细胞含有表面结合与内在化的脂蛋白, 为了区分它们, 在用0.1M NaOH溶解细胞之前, 应使表面结合的脂蛋白从细胞上被释放。
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方案6: 表面结合与内在化脂蛋白的测定
(1). 孵育之后, 将细胞冷却(冰上15分钟), 移取孵育培养基作降解测定。 (2). 用冷PBS-BSA迅速洗涤细胞三次,随后进行两次冰上PBS-BSA孵育,各10分钟。
(3). 加入脂蛋白分离试剂, 冰上冷孵育并轻摇1小时。
(a). LDL可用4mg/ml硫酸右旋糖酐或10mg/ml的肝素PBS溶液将其从细胞表面受体上释放出来。
(b). 亲合力比LDL高的脂蛋白, 如含Apo E的脂蛋白, 可用PBS内含30mg/ml的磷酸钠玻璃(六甲基磷酸钠, 9-V030,J,T.Baker或Phosphate Glass, P-8510,Sigma)使之释放。
(4). 移取一份已知量至12×75mm试管,进行r-计数。
(5). 吸出剩下的溶液, 用PBS洗涤单层细胞两次。加入0.1M NaOH, 以后按方案4继续进行。
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(二)、降解分析
与LDL受体结合后, 125I-标记脂蛋白被内在化并在溶酶体内降解成氨基酸。降解分析法测定释放到组织培养基中的125I-标记酪氨酸。这一分析法的原理是:用三氯醋酸(TCA)沉淀法除去培养基中残留的完整125I-标记脂蛋白, 去除任何游离的125I, 然后测定125I-标记酪氨酸及小分子多肽的放射活性。
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方案7: 脂蛋白降解的测定
(1). 对两套12×75mm和一套13×100mm玻璃试管预先编号。
(2). 在其中一套12×75mm试管中加入PBS-BSA溶液,使其与细胞中的孵育培养基总体积为1ml。细胞置于冰上之后,将培养基移入含PBS-BSA液且已编好号的12×75mm试管中, 洗涤单层细胞, 按方案4进行计数。
(3). 用连续加样器在每支装有1ml培养基PBS-BSA的试管内加入200ul 50%TCA, 涡旋混合, 4℃孵育30分钟。
(4). 在4℃下2000g离心15分钟, 形成TCA沉淀。将1.0ml上层清液移入已编好号的13×100mm试管。用连续加样器在每管中加入10ul 40%KI和40ul 30%H2O2。涡旋混合,室温孵育5-10分钟。
(5). 每管中加入2ml CHCl3, 彻底旋混(上层水相应为淡粉红或淡黄色, 不是深褐色,若呈深棕色, 则需重新旋混)。H2O2将[125I]碘化物转化为[125I]碘, 后者可用氯仿萃取。用100g-200g离心5分钟将水相与氯仿相分开, 吸取625ul上层水相至第二套12×75mm试管内, 塞好, 进行放射活性计数。总降解量=c.p.m×2。