第三节  培养细胞中胆固醇酯形成的分析

    细胞以胆固醇酯形式贮存过剩的胆固醇。若将[14C]油酸盐加入培养基, 则对[14C]油酸胆固醇的测定是胆固醇酯形成的精确指标。该法是根据Goldstein等人的方法改良而来。

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    方案8: 胆固醇酯化测定

    (1). 将细胞与含待测脂蛋白及[14C]油酸钠─白蛋白复合物的DMEM在37℃下孵育6-16小时。因为血清和LPDS促进胆固醇从细胞中流出, 所以当细胞在无LPDS或无血清的DMEM中孵育时测得的胆固醇酯形成更多。

    (a). 成纤维细胞和平滑肌细胞所用的[14C]油酸钠─白蛋白复合物终浓度为0.1mM, 巨噬细胞所用的浓度为0.2mM。

    (b).降解试验中所用的脂蛋白浓度对于胆固醇酯合成也有影响。若使用125I─标记蛋白, 则可用同样细胞进行胆固醇酯合成和降解测定。任何被125I-标记蛋白污染的类脂都在薄层层析过程中被分离出, 此类蛋白停留在原处。

    (c). 还要设2-4个孔用于"无脂蛋白"背景对照, 其中加有培养基及[14C]油酸钠-白蛋白,  但没有脂蛋白。

    (2). 孵育终止时, 将细胞置冰上的金属盘中, 吸出培养基或保留其作降解分析, 按方案4, 用PBS─BSA和PBS洗涤单层细胞。

    (3). 每孔用含油酸[3H]胆固醇内标准的正已烷:异丙醇(3:2)萃取。内标准d.p.m应略大于存在于最高脂蛋白浓度中的最大14C d.p.m(初始近似值为每孔50000-75000d.p.m)。若需要增加体积, 则加入正已烷:异丙醇(3:2)混合液。若需100%值, 直接将同量油酸[3H]胆固醇内标准加入三个闪烁瓶内, 在通风橱内使溶剂蒸发。平皿置旋转平台式荡动器上, 室温下对细胞单层进行30分钟萃取。注意平皿要加盖以减少蒸发。萃取后将每孔的溶剂移入12x75mm试管, 用等量的正已烷:异丙醇(3:2)冲洗各孔一次。各试管可用箔片覆盖, 贮存于-20℃备用。

    (4). 单层细胞干燥几分钟后, 按方案4所述将其溶于0.1N NaOH。

    (5). 37℃下用N2吹干萃取溶剂, 其中含有细胞的[14C]油酸胆固醇和油酸[3H]胆固醇内标准。

    (6). 将类脂溶于50ul氯仿:甲醇中, 并将其涂到有槽的、预吸附的硅胶薄层层析(TLC)的平板上。平板一端的槽可用来涂上中性类脂混合物或油酸胆固醇溶液作为标准。但加到内标中的未标记油酸胆固醇应易于分辨。

    (7). 将平板置预平衡及内衬滤纸的含有100ml正已烷:二乙醚:氨溶液(90:10:1)的层析槽内进行冲印显影。室温下冲印25-30分钟或直到溶剂前沿距板顶2-4cm。在通风橱内风干。

    (8). 在层析槽内用碘蒸气使类脂带显现, 层析槽内仿含有碘结晶, 为避免平板与结晶直接接触, 将平板底部放入槽底。显色需要5-10分钟。

    (9). 在这一溶剂系统中, 胆固醇酯带是最高的带, 恰好在溶剂前沿之下。用刀片在硅胶上划痕标记此带, 在通风橱内让碘挥发。用刀片刮去胆固醇酯带之上的硅胶, 然后将每条胆固醇酯带刮到称量纸上, 再将其倒入标号的闪烁瓶中。

    (10). 加入无水闪烁混合物, 用双标记样本程序计数放射活性, 同时对只含3H-标记内标准的各瓶计数。

    (11). 所形成胆固醇酯的量按以下公式计数:

                                              100%油酸³H胆固醇

                         样品中[¹⁴C](d.p.m) x ───────────

                                                                                                     样品中³H(d.p.m)  

[¹⁴C]油酸胆固醇(pmol) = ─────────────────────────

                                                [¹⁴C]油酸钠的比活性(d.p.m/pmol)

胆固醇酯(pmol)       [¹⁴C]油酸胆固醇(pmol)

───────── = ──────────────

细胞蛋白 (ug)        每皿有细胞蛋白(ug)

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