第四节 膜结合分析
在原膜或去垢剂增溶的原膜上可进行受体分析。一般采用改良的Basu等及Schneider等人的方法。
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方案9: 从培养细胞上制备膜
(1). 大培养皿(100mm)上的细胞按方案1传代培养后, 在冰盒上的金属盘内冷却, 用4-5ml含0.2%BSA的冷PBS洗涤两次, 再用5ml冷PBS洗涤一次。
(2).用橡胶刮片或塑料细胞刮片将细胞从培养皿上刮下, 将皿倾斜, 收集细胞。用1-2ml冷PBS冲洗培养皿, 将刮出的细胞收集于50ml塑料离心管中。
(3). 4℃下800g离心5 分钟, 吸去上层清液, 留下细胞沉淀, 在-76℃下冻存备用。
(4). 每份细胞沉淀物加入1ml冷的10mM Tris-HCl 150mM NaCl2(pH7.4)的混合液。将沉淀物再悬浮于缓冲液中, 将各管内成分混匀。
(5). 在Polytron匀浆器中用8#小探针使细胞裂解, 匀浆10秒, 置冰上冷却1分钟, 再匀浆10秒。
(6). 4℃下将匀浆以800g离心5分钟, 将上层清液移入38.5ml同质异晶聚合物试管内, 在Beckman L8-70中用60Ti转子以31000r.p.m(100000g)离心60分钟。
(7). 离心后, 用切管机从离心管底大约1英寸处将管切开, 倾倒弃去上层清液。将切下的含沉淀物部分放入50ml塑料离心管中(一支心管可放入2-3支管中的沉淀 物), -76℃下保存。
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方案10: 从肝脏组织制备膜
(1). 取出肝脏, 将其置冷的0.15M NaCl溶液中。以下各步操作均在4℃下进行。
(2). 将1克肝脏组织置入含有10ml缓冲液的polytron匀浆器中, 进行两次10秒钟的匀浆处理。缓冲液成份为10mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1mM CaCl2及0.5mM氟化苯甲基硫酰(PMSF), pH7.5(A缓冲液)。
(3). 将肝脏匀浆以500g离心5分钟, 收集上层清液, 将其以8000g再离心15分钟。弃去沉淀物。
(4). 将经8000g离心所得的上层清液以100000g 4℃下离心60分钟, 将离心后所得的沉淀物用22号针头吸搅10次, 使其再悬浮于A缓冲液。
(5). 将此悬液以100000g离心60分钟, 使之再沉淀 。
(6). 立即测定最终所获得的沉淀物, 或将其在液氮中冰冻, 并于-80℃下贮存2周。
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一、去气膜分析
去气膜分析按方案11进行。
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方案11: 去气膜分析方法
(1). 在冰冷的B缓冲液中(20mM Tris-HCl; pH7.5, 1mM CaCl2, 50 mM NaCl)用带22号针头的注射器使膜悬浮。用Lowry的方法测定蛋白浓度。
(2). 用等体积的改良缓冲液(80mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM CaCl2, 40mgBSA/ml)稀释。然后用C缓冲液(等量B缓冲液与改良缓冲液混合)使蛋白浓度范围为2-6mg/ml。
(3). C缓冲液中125I─标记脂蛋白浓度应为要求的终未孵育浓度的5 倍。终未脂蛋白浓度应等于4℃下受体结合分析时的终浓度(如LDL=0.2-0.25ug/ml, apoE-HDL=0.01-1.8ug/ml)。
(4). 在1.5ml的微量离心管中加入: 20ul C缓冲液; 20ul 125I-标记脂蛋白溶液; 60ul含膜溶液。
因为脂蛋白与LDL受体的结合需要钙, 所以过量的EDTA会破坏脂蛋白-受体的相互作用。在孵育混合物中加入20ul含100mM EDTA的缓冲液替代C缓冲液可作为非特异结合的对照。
(5). 旋转混合混合物, 置冰上孵育60分钟。孵育期间将100ul FBS加入到已编号的去气膜管中。
(6). 孵育完毕后, 旋转试管, 将75ul孵育混合物覆于去气管内的FBS上。4℃下以30p.s.i(135000g)去气离心30分钟。
(7). 用注射器或带细吸管的微针吸管移去上层清液, 在不破坏沉淀层的情况下往管中加入175ul的FBS, 再以30p.s.i离心10分钟。
(8). 移去上层清液, 用刀片在沉淀层之上切开去气管。将带有沉淀物的管底部分装入一支12x75mm管中, 加盖, 在r-计数器上计数。若没有去气离心机, 可用带TL100.2转子的Beckman TL100台式超速离心机。
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二、可溶受体的测定
本方法包括用丙酮/卵磷脂(PC)将受体从含去垢剂的溶液中沉淀下来, 再将受体与125I-标记脂蛋白一起孵育, 最后将脂蛋白-受体复合物用醋酸纤维膜收集。
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方案13: 可溶受体测定步骤
(1). 在17x100mm带盖的聚丙烯管中混入: 2.7ml PC稀释缓冲液(50mM Tris 顺丁烯二酸, pH7.2, 0.2 mM CaCl2, 50mM PMSF, 用前新加入); 1.5ml含2mg/ml的PC溶液(在加样时充分混匀); 0.5ml受体样本。制备2mg/ml PC溶液方法是: 将200mg(10ml)鸡蛋卵磷脂(Egg Lecithin, Avanti Polar Lipids)加入到100ml园底烧瓶中, N2吹干。加100ml PC稀释缓冲液, 用力震摇5分钟。该PC溶液存于4℃下, 应在2-3周内使用。
(2). 边涡旋混合边加入3.3ml -20℃的丙酮(超级纯)。在0℃下以20000g离心20分钟(12000r.p.m, Beckman J2-21离心机, JA转子)。
(3). 吸去上层液, 将沉淀物再悬浮于240ul C缓冲液-BSA中(50mMTris,pH7.5, 25mM NaCl, 1mM CaCl2, 20mg BSA/ml)。
(4). 在0.5或1.5ml微离心管中混入: 25ul C液-BSA或含100mM EDTA的C液-BSA; 25ul 125I-标记的配体溶液; 75ul样本(充分混匀)。
将BSA─C缓冲液中5倍终未孵育浓度的125I标记脂蛋白通过0.45um醋酸纤维膜注射到过滤器进行过滤。使用方案12中所给的终未脂蛋白浓度。混合物置冰上孵育至放2小时。
(5). 孵育期间, 准备适合于真空歧管(0.45um孔径, Oxiod LTD)的醋酸纤维膜, 他们都是单向膜, 在整个操作中应确保正面向上。在35mm组织培养皿上用3ml洗液(20mM Tris, pH7.5, 1mM CaCl2, 50mM NaCl, 1mg BSA/ml)将膜预先分开浸泡。用摄子将膜的正面向上放置于真空歧管上, 用3ml冷洗液洗涤。关闭真空, 每张膜上加3ml洗涤缓冲液。
(6). 混合各孵育管, 等分出90ul, 加在滤膜上的缓冲液中。通过真空将缓冲液通过滤膜, 用3ml洗涤缓冲液洗涤每张滤膜4次。
(7). 用细镊子取下膜, 将其置于12x75mm管上进行r计数。
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