第五节  配体印迹

    1983年, 有人报道通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后, 可用配体印迹法将LDL受体转移到硝酸纤维素薄膜上并进行检测。此后, 这一技术被广泛应用于鉴定原膜提取物中的受体。在配体印迹中, 分离的受体在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳, 然后电泳转移到硝酸纤维素薄膜上。将带印迹的硝酸纤维薄膜在含受体配基的溶液中孵育, 可使配体与印迹上的受体结合。若配体是经同位素标记的, 那么受体可用放射自显影定位。

    配体印迹可提供一些受体结合分析不能获得的信息:

    (1). 受体分子量的测定;

    (2). 鉴定无抗-受体抗体的受体;

    (3). 确定配体和细胞表面的特定分子相互作用。

    配体印迹的解释必须十分慎重。因为有时易得出"人为的结论"。例如, 此技术只有当受体经过SDS电泳后仍保持有配体结合能力时才有效。第二个主要问题是, 配体可能会与一种蛋白质结合, 此种蛋白质不是生理性受体但可与配体印迹上的配体相互作用。最后, 如果配体过于"粘附", 它可与硝酸纤维素薄膜牢固结合, 造成高背景而掩盖了特异结合。目前, 多数人采用Daniel等人的改良方法。

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    方案14: 配体印迹方法

    (1). 凝胶电泳样本的应用缓冲液应不含还原剂, 样本不应加热。

    (2). 电泳转移后, 在丽春红S中将硝酸纤维素薄膜染色数分钟。丽春红S为一种水溶性染料, 它可将蛋白染红, 使其短时显现(可用于照相), 但在随后的步骤中可被洗掉。

    (3). 为使结合到硝酸纤维素薄膜上的非特异蛋白尽可能减少, 在室温下用5%印迹缓冲液(肉色无脂干牛奶溶于50mM Tris, 2mM CaCl2, 80mM NaCl混合液中,pH8.0)孵育60分钟或4℃过夜。

    (4). 移走印迹缓冲液, 用含125I-标记配体(5-10ug/ml)的新鲜缓冲液替代。

    (5). 在振荡器或旋转平台上将印迹室温孵育2-4小时或4℃过夜。

    (6). 孵育后, 冲洗后印迹三次, 继之用印迹缓冲液洗涤两次, 每次10分钟。用蒸馏水漂洗, 凉干, -70℃下用增影屏进行放射自显影。

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