第二节  样本的制备和贮存

    一 血浆

    注射肝素, 使LPL与HL以酶-肝素复合物的形式从组织部位释放出来。对HL而言, 肝脏中结合的HL与血浆中同肝素一起循环的HL已达到平衡。相反, LPL被肝脏摄取并很快被代谢。因此, LPL的活性代表释放入血与从血中摄取之间的平衡。肝素可以促进释放而阻碍摄取, 但不完全阻断。注入肝素后, HL活性迅速升高, 而LPL活性升高较平缓。长时间后酶活性衰减主要因肝素被清除所致。对在大多数哺乳动物按50-100Iu肝素/Kg体重给药可达到最大脂酶释放。通常在注射5-10分钟后。　当两种脂酶均显示最大或接近最大活性时抽取血样本。收集肝素处理后血浆的方法见方案9。

    肝素后血浆LPL和HL活性在不同个体间差异很大。不同情况下测定同一个体的值基本相同。

────────────────────────────

    方案9: 人类肝素后血浆的收集

    (1). 按100Iu/Kg体重静脉注射肝素。

    (2). 15分钟后, 抽血放入肝素化真空试管中。

    (3). 马上置冰水上冷却, 保持脂酶活性。

    (4). 低速离心, 使血细胞沉淀, 收集血浆。若血浆甘油三酯含量很高, 离心后表面会形成脂肪块。有些脂酶会与这些脂类结合。因此要将其与血浆一起回收测定脂酶活性。

    (5). 立即测定脂酶活性或存于-70℃下。通常认为活性是相当稳定的, 但也不主张反复冻融。

────────────────────────────

    基础血浆中的HL和LPL活性低, 按方案9第3-6步收集和处理样本, 应使用肝素作抗凝剂而不用柠檬酸或EDTA, 因为肝素使LPL稳定(也可能使HL稳定)。

    二、组织提取

    分析组织中LPL活性的两个主要途径是测定总活性和/或测定可被肝素释放的活性。假定肝素可使LPL从血管中释放, 而这些是直接参与脂蛋白代谢的酶。　其余的部分可能在细胞内。例如, 大鼠心脏灌注肝素后, 随其营养条件的不同, 很快释放5-25%的总LPL活性。

    (一)、 组织块的肝素洗脱液

    有几种从组织中洗脱LPL的方法。他们适用于用活检针取下的小块样本。回收活性设定为内皮细胞LPL和一些其他细胞内LPL的和, 后者在提取过程中被分泌出并通过在溶媒中灭活/降解达到平衡。有人主张用6倍体积的Kreb's Ringer磷酸盐缓冲液和25%人血清[其中含肝素50ug/ml(大约7.5Iu)], 提取脂肪组织块(50mg)。在37℃下孵育30分钟后, 取0.2ml样本用于酶活性测定。这一方法利用了肝素和血清成分(可能为脂蛋白)对LPL的稳定作用。亦有人主张在4℃下提取, 使灭活尽量减少。也有人采用富含甘氨酸的缓冲液使LPL稳定, 还使用了标记甘油三酯底物, 这样提取与水解可同时发生。

    (二)、全组织活性

    在早期的研究中, 常采用组织的丙酮:乙醚粉末提物进行测定LPL活性。这一方法有几个优点:

    1. 若在-70℃下贮存(干燥的), 在粉末中的LPL活性相当稳定。

    2. 类脂被清除, 否则会影响测定。

    3. 其它一些脂酶如脂肪组织中的激素敏感脂酶被灭活。

    缺点是粉末提取中LPL活性的回收往往不完全。一般推荐使用与组织匀浆一样的缓冲液。在用匀浆或处理将其分散之前, 让粉末浸泡于缓冲中。离心使不溶物沉淀 , 在清亮上层液中测定脂酶活性。

    用不含肝素和/或去垢剂的缓冲液制备的组织匀浆也可用于LPL测定。这一方法并不可取, 因为不溶物中残留相当数量的脂酶活性。

    从匀浆提取/溶解LPL的最有效方法是用含去垢剂的缓冲液。其优点是在这种缓冲液中LPL在4℃下可稳定数日, 在室温下可稳定数小时。几种不同的去垢剂混合物已被采用。他们多数也含有蛋白酶抑制物。方案10的设计也适合于免疫测定与免疫沉淀。含去垢剂的缓冲液也可用于培养细胞的增溶, 并较适宜于提纯LPL的稀释, 例如用于测定时。上述LPL溶液可与肝素-琼脂糖结合, 用于这一目的时, 缓冲液中应不含肝素。当提取物的蛋白浓度较低时, 若缓冲液中有牛血清白蛋白(1mg/ml); 回收率和稳定性都可提高。

    肝素-去垢剂缓冲液也能有效地从肝脏和类固醇分泌腺中提取HL。

───────────────────────────

    方案10: 在含去垢剂的缓冲液中制备组织匀浆。

    (1). 制备缓冲液: 25mM氨, 用HCl调节pH至8.2, 其中含5mM EDTA, 另外每ml含10mg Triton X-100、1mg SDS、5IU肝素、10ug leupeptin (Boegringer)、1ug pepstatin 和25KIU Trasylol(Sigma)。Leupeptin和pepstatin(1mg/ml)的贮存液用95%乙醇制备。Triton和SDS的比例至少是10:1, SDS比例过高会使LPL变性。

    (2). 用Polytron匀浆器在冷(4℃)缓冲液中将组织匀浆(1g组织, 9ml缓冲液)。将匀浆放置冰上。

    (3). 在4℃下20000g离心20分钟, 回收清亮的上层清液。对脂肪组织, 回收上浮的类脂与沉淀物之间的透明相(采用注射器)。

    (4). 6小时内测定LPL活性, 提取物常常可冷冻, 但每次实验时应该检查回收率。

────────────────────────────