二、LCAT催化活性的测定
因为内源性游离胆固醇的酯化速度反映出HDL底物颗粒的数量和质量, 除了测定LCAT浓度外, 也可在过量加入外源性底物的情况下进行血浆游离胆固醇酯化的测定。最先报道的方法是将受试血浆与8倍体积的人类血浆共同孵育, 预热以破坏内源性LCAT的活性。并用[14C]游离胆固醇放射标记。但这一方法存在固有缺点: 首先, 建立各实验室之间的标准并不实际; 尽管使用不同底物时各试验血浆保持相对活性, 但特定样品的绝对值变化很大。其次, 底物制备的加热步骤可导致脂蛋白反应朝LCAT方面改变。还要注意内源性脂蛋白的影响并不能完全排除, 因为尽管起初没有标记, 但它占总量的10%。因而有人提出要改进此方法。最初建议使用分离的HDL3, 但最近又提出使用一种更明确更理想的蛋白脂质体底物。血浆LCAT活性的这种测定方法学详见方案4, 受试血浆用前述Stokke-Norum方法制备, 但孵育步骤和计算方法不同。
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方案4: 加热血浆底物法测定LCAT活性
(1). 制备标记底物:
(a)在56℃将适量(10-50ml)正常人新鲜血浆(最好是来源于多个受试者)加热30分钟。
(b)冷却, 20000g离心20分钟。
(c)每1ml透明上层清液与0.125ml放射标记的游离胆固醇/HSA乳剂(见方案1)相混合, 37℃孵育8小时, 然后4℃孵育过夜。这一底物可在4℃下保存一周, -20℃或更低温度下可存放为数月(但不宜反复冻融)。
(2). 按下列步骤孵育底物:
(a)将0.18ml标记底物加入带螺旋帽的试管中, 冰浴中冷却。
(b)每份受试血浆各取20ul加入双份试管中, 空白管中加20ul盐溶液。
(c)将各管分别混匀, 置37℃孵育4小时。
(d)将所有试管移至冰浴中, 快速加入4ml CHCl3-MeOH(2:1), 混匀, 按方案2及3完成类脂提取及测定。
(3). LCAT活性用每小时每1ml试验血浆被酯化的游离胆固醇的nmol数表示, 不要用酯化百分比表示。首先计算每份受试血浆的放射活性酯化与胆固醇酯的百分比,减去空白值。然后测定受试血浆和标记底物的游离胆固醇含量。计算每10ml孵育混合物(等于1ml试验血浆)的游离胆固醇总量(nmol)。将其与游离胆固醇酯化百分比相乘, 再除以4小时, 就得知LCAT的活性(nmol/ml/h)。
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(一)、蛋白脂质体(proteoliposome)底物法
标准测定所需的试剂如下:
测定缓冲液: 10mM Tris-HCl(pH7.4), 含140mM NaCl和1mM Na2EDTA。
游离胆固醇(1mg/ml), 溶于双蒸馏正已烷中。
[4-14C]游离胆固醇(55uCi/umol), 100uCi/ml溶于甲苯。
人Apo AI(1mg/ml), 溶于测定缓冲液。
胆酸钠(0.725M), 溶于测定缓冲液。
制备标记蛋白脂质体的胆酸盐透析法及孵育条件分别见方案5和6。
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方案5: 用胆酸盐透析法制备标记蛋白脂质体底物
(1). 吸取870ul卵磷脂, 250ul游离胆固醇及20ul[14C]游离胆固醇, 放入一干净试管中, 用N2吹干。
(2). 加1.7ml测定缓冲液, 1ml Apo AI及340ul胆酸盐溶液到上述试管中, 室温下涡旋混合1分钟。
(3). 4℃下用测试缓冲透析2-3天, 每天换液4次(每次1升). 以确保完全清除抑制性胆酸盐。
(4). 用测定缓冲液将透析液体积加至4.5ml, 底物可马上使用或分装(0.1ml)保存于-20℃可达3周。
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方案6: 蛋白脂质体底物的孵育方法
(1). 每支带螺旋盖的测定管内加入0.235ml测定缓冲液, 0.125ml溶于测定缓冲液中的2%HSA及0.1ml蛋白脂质体底物(方案5)。
(2). 37℃下孵育20分钟, 然后加入25ul 0.1M巯基乙醇和15ul试验血浆(空白管用测定缓冲液代替)。
(3). 混匀后置37℃下孵育足够1小时, 加入3.75ml CHCl3-MeOH(1:2)终止反应, 混匀, 再加入1.25ml CHCl3和1.25ml H2O。
` (4). 按方案3完成薄层层析和放射活性计算。
(5). 按前述方法计算LCAT活性, 一般受试血浆中的游离胆固醇含量可忽略不计, 结果可用酯化百分比或nmol/ml/h表示。
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三、LCAT浓度测定
可采用免疫学方法测定LCAT的浓度, 包括采用双抗体放射免疫测定及Laurell免疫电泳法。虽然用蛋白脂质体(前述)测定的正常血浆中LCAT活性与放射免疫法测定的LCAT蛋白之间具有良好的相关性, 但后者能避免产生与游离胆固醇酯化测定有关的问题。而且在异常血浆中(如家族性LCAT缺乏病人的血浆)可能出现LCAT的酶学损坏及失活形式, 而这些可用免疫学方法检测出来。由于LCAT的多克隆或单克隆抗体尚存在某些问题, 所以免疫学方法测定LCAT的浓度还没有被推广应用。