第二节   乙酰辅酶A胆固醇酰基转移酶

    一、标记脂肪酸掺入细胞胆固醇酯中

    Goldstein等人首次报道皮肤成纤维细胞摄取LDL后[1-14C]油酸掺入胆固醇酯中。在其他培养细胞也进行了类似的测定, 包括通过受体介导途径从宿主获取类脂的寄生微生物如非洲锥虫。而乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)的真正底物:辅酶A(CoA)的一种脂肪酰酯并未被采用。因为后者不象油酸能透过胞浆膜。因此本方法不是绝对测定ACAT活性, 而是测定一个转移过程和两个酶学反应的产物活性。这两个酶学反应是指油酸转化成它的CoA酯及随后酯化成游离胆固醇。不管怎样, 至少在成纤维细胞中, [14C]油酸在胆固醇酯中的掺合与用[14C]油酰-CoA作底物在同一细胞微粒体中测定的ACAT活性之间存在良好的一致性。

    测定所需要的材料如下:

    (一)、组织培养试剂:

    Dulbecco's改良的Eagle's培养基(DMEM)加有青霉素(100u/ml), 链霉素(100ug/ml)和10%牛胎血清。

    Dulbecco's磷酸盐缓冲液(PBS)。

    (二)、脂蛋白: 如第一节所述, 制备人LDL1.019-1.063g/ml和无脂蛋白血清(LPDS), 用含0.3mM Na2EDTA和10mM PBS的0.15M NaCl(pH7.4)彻底透析。用前经0.22um滤膜灭菌。

    (三)、[14C]油酸/HSA乳剂:

    1. 吸取50uCi的[1-14C]油酸(57uCi/umol)加到一干净管内, N2吹干溶剂。另外可取125uCi[9,10-3H]油酸, 用未标记油酸稀释到比活性为25mCi/mmol, 代替上一种溶液。

    2. 加热到60℃, 使之再溶于0.1ml 0.02M NaOH中, 涡旋混合使其澄清。

    3. 逐滴将热溶液加入含1.5mg HSA的0.9ml PBS中, 同时涡旋混合。再将其移入原来的管内; 涡旋混合。然后乳剂经0.22um滤膜, 即可供使用或于-20℃保存, 一月内使用。

───────────────────────────

    方案7: 通过细胞培养和孵育将标记脂肪酸掺入细胞胆固醇酯中。

    (1). 让细胞在含有添加DMEM(见组织培养试剂中所述)的60x15mm塑料培皿中生长, 直到对数生长后期(如接近融合)。

    (2). 用PBS洗涤单细胞层两次, 用含LPDS代替FCS的培养基预孵育24小时, 使LDL受体表达到最大值。

    (3). 用含LPDS和不同量试验添加剂(如LDL: 0-600ug LDL-胆固醇/ml)的新鲜培养基再灌满, 孵育6小时, 然后加40ul[14C]油酸/HSA乳剂。

    (4). 孵育2小时后, 用冰冷的PBS洗涤细胞两次, 再刮取收集细胞。

    (5). 将PBS中的细胞移入一玻璃管中, 离心(800g, 30分钟, 4℃), 用0.4ml H2O溶液沉淀细胞。

    (6). 边旋混边加入3ml CHCl3-MeOH(1:2)溶液, 其中含有105d.p.m[7-3H]游离胆固醇和油酸胆固醇各40ug。

    (7). 离心, 将上层清液转入一干净试管中后, 使残留的溶剂蒸发干净, 再将蛋白残余物(约400ug)溶于1ml 0.1M NaOH中进行随后的测定。

    (8). 上层液中加1ml CHCl3和1ml H2O, 涡旋混合, 如方案3所述用薄层层析分离下层相中的[3H]游离胆固醇和[14C]胆固醇酯。

    (9). 计数后校正每块培皿内部[3H]游离胆固醇的回收率(常为80%左右), 再用[14C]油酸的比活性来以每小时mg细胞蛋白生成的胆固醇醇(nmol)数表示结果。

────────────────────────────