二、微粒体内ACAT活性测定

    ACAT活性直接测定尚存在一些有关的方法学问题。要进行亚细胞分离以制备含酶的微粒体成份。最好的底物是[14C]油酸-CoA; 而棕榈酰-CoA对另一种微粒体酶(乙酰-CoA水解酶)进行的降解特别敏感, 而应用[14C]标记的游离胆固醇时, 因其与内源性微粒体游离胆固醇之间出现难以确定的平衡, 使操作更为麻烦和复杂。　但是, 测定混合物中必须添加外源性游离胆固醇(作为富含胆固醇的脂质体或去垢剂的分散相)使ACAT活性更满意; 同时加入硫醇(巯基)以保持ACAT的活性-SH基团。还应有不含脂肪酸的BSA以预防油酸-CoA破坏微粒体膜的去垢作用。方案8和9所述的方法是以Bilheimer方法为基础, 鼠卵巢、昆虫组织及酵母菌等系统的测定是可靠的, 且较为合适。

    测定ACAT活性所要求的试剂如下:

    (a)测定缓冲液: 0.1M磷酸钾(pH7.4), 含1mM还原谷胱甘肽。

    (b)BSA: 20mg/ml溶于测定缓冲液中。

    (c)游离胆固醇/Triton WR-1339贮液: 33.4mg游离胆固醇及1g Triton WR-1339, 溶于10ml丙酮中。

    (d)游离胆固醇/Triton WR-1339工作液。每日制备10个样本所需液体: 带螺旋盖的管内加入1ml测定缓冲液, 称重并加热至60℃。将60ul贮存液加热到60℃以确保游离胆固醇被溶解, 逐滴加入到测定缓冲液中, 边加边涡旋混合。按方案1用N2吹干丙酮, 再称重试管, 并计算所失的水量; 边涡旋混合边逐滴加水还原。终溶 液应透明(混浊溶液会使结果假性偏低, 应弃去)且每ml含520nmol游离胆固醇及6mg Triton WR-1339(测定混合物中的终浓度为0.3%)。

    (e)[1-14C]油酸-CoA(5000d.p.m/nmol) 1mM, 溶于0.01M磷酸钾中(pH6.0)。用前以未标记油酸-CoA稀释购置的标记油酸-CoA(50-60uCi/umol, N2下-80℃贮存以防分解)。

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    方案8: 微粒体制备

    (1)用冰冷的0.25M蔗糖充分灌注原位组织或器官。在含10mM烟酰胺的2.5容积测定缓冲液中匀浆处理。

    (2)用不同的速度离心(最终离心速度为105000g, 12小时, 4℃)制备微粒体。

    (3)当天使用时, 用测定缓冲液洗涤一次。若在N2下-20℃或更低温度贮存时,用含烟酰胺的缓冲液洗涤微粒体, 解冻后再单独用测定缓冲液洗涤。

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    方案9: ACAT活性测定的孵育步骤:

    (1)每只带有螺旋盖的试管内加入100ug微粒体蛋白(对照组先煮沸), 50ul BSA溶液及100ul游离胆固醇/Triton WR-1339 工作液。

    (2)加测定缓冲液至0.18ml, 并将试管在37℃预孵育30分钟。

    (3)每间隔15秒加入20ul[14C]油酸-CoA到各管中并混匀。正好10分钟后, 在第一管内加4ml含40ug油酸胆固醇及40000d.p.m[14C]游离胆固醇分别作载体及内标准 的CHCl3-MeOH(2:1), 以终止反应。

    (4)其它管以15秒钟间隔重复上述操作。

    (5)加0.8ml水, 如前述用薄层层析下层相中的[14C]胆固醇酯和[14C]游离胆固醇。

    (6)计数, 并对[14C]游离胆固醇的不完全回收进行胆固醇酯放射活性校正。微粒体内ACAT活性以每分钟每mg蛋白形成的油酸胆固醇nmol表示。

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