胆固醇合成酶测定
生物体内的胆固醇合成需要有许多酶的参与, 其中三羟基三甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的作用非常重要, 因为该酶是胆固醇合成过程是的限速酶。在哺乳动物, HMG-CoA还原酶主要位于内质网, 其催化域面对胞浆。组织内的活性测定一般在微粒体上进行。从微粒体中制备的具有催化活性的水溶性蛋白片段也可被采用。测定培养细胞中HMG-CoA还原酶时, 用去垢剂增溶的全细胞提取物很易获得, 当然也可采用微粒体。
第一节 样本准备
一、重要参数
(一)、活体内HMG-CoA还原酶的活性呈昼夜变化。大鼠保持12小时" 黑白"周期交替, 最大活性出现在黑夜期中段。还原酶活性在这一周期中变化可高达10倍。因此准确计时很重要。
(二)、在HMG-CoA还原酶测定过程中, 与HMG-CoA竟争的反应应控制在最小范围。象HMG-CoA裂解酶的线粒体在诸如肝、肠等生酮器官中特别丰富, 但通过细致的细胞分离可使从这些器官得到的匀浆中不含这些酶。
(三)、微粒体内HMG-CoA还原酶的增溶似乎是通过溶酶体巯基蛋白酶介导的。可溶酶及微粒体酶尽管在动力学常数上有些差别, 但他们均具有活性。若需要完整的微粒体酶, 最重要的是分离出无溶酶体的微粒体, 即在分离过程中没有接触溶酶体蛋白溶解酶。所以, 在分离缓冲液中应加入leupeptin以抑制巯基蛋白酶, 还可加入250mM蔗糖以保持溶酶体及其它细胞器的完整性。
(四)、当半胱氨酸残基被氧化时, HMG-CoA还原酶被可逆性灭活, 细胞内的酶活性取决于细胞内巯基/二硫化物状态, 关于这一点还有争议。为了制备能反映他们所在细胞中巯基/二巯基化合物状态的微粒体, 分离缓冲液中应不含还原剂。
(五)、磷酸化可使HMG-CoA还原酶可逆性失活。在样本制备中, 内源性磷酸酶可使酶激活。这可在进行匀浆制备时加入氟化物一类的磷酸酶抑制剂以避免其发生。
二、微粒体内HMG-CoA还原酶 此处介绍鼠肝微粒体的制备。对其他组织和培养细胞也可用相似的方法, 只需略加改动。例如, 脑匀浆中大部分HMG-CoA还原酶活性存在于低速离心后的沉淀物中, 还伴随有其他微粒体标记物, 这可能是由于捕获或与髓磷脂反应的结果。
将大鼠处死, 立即取出肝脏, 置于冰匀浆缓冲液中。方案1介绍了制备微粒体的方法。按方案1进行的微粒体HMG-CoA还原酶分离可因反复冻融所致的蛋白裂解而降至最小程度。为分离出已溶解酶, 应在无leupeptin的情况下制备微粒体。
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方案1: 从鼠肝中制备微粒体
(1). 在冰上将鼠肝用剪刀剪成细小块a。
(2). 用匀浆缓冲液Ab快速洗涤。
(3). 将组织悬浮于匀浆缓冲液中(5ml/g肝脏)。
(4). 用手动松套的Dounce匀浆器进行匀浆。
(5). 16000g离心15分钟。
(6). 16000g再离心上层清液15分钟。
(7). 小心移出上层3/4的清液, 不要吸入沉淀物。
(8). 100000g离心上层清液1小时。
(9). 弃去上层清液, 将沉淀物悬浮于匀浆缓冲液A中(2.5ml/g原肝组织)。
(10). 100000g离心已悬浮的沉淀物1小时。
(11). 弃去上层清液: 沥干管内残存的液体。
(12). 微粒体沉淀物用液氮冰冻并在-70℃下存放。
a: 所有操作在0-4℃下进行。
b: 匀浆缓冲液A含50mM盐酸咪唑, pH7.2, 250mM庶糖, 20mM EDTD及50uMleupeptin。
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方案 2: 微粒体HMG-CoA还原酶的增溶
(1). 按方案1制备微粒体, 作如下变动: 用下列匀浆缓冲液Ba, 并使用电动紧套的玻璃-Telfon Potter-Elvehjem匀浆器。
(2). 以大约80mg/ml浓度的悬浮微粒体于匀浆缓冲液B中, 并加入固体二硫苏糖醇使其终浓度为10mM。
(3). 用手动玻璃Potter-Elvehjem匀浆器(0.04-0.006"间隙)浆微粒体匀浆, 以后的步骤中用同样的匀浆器。
(4). 每3ml分装于玻璃管中, 以每分钟降温6-8℃的速度冻至-20℃, 样本于-20℃下贮存。
(5). 测定时将微粒体HMG-CoA还原酶增溶。37℃下解冻样本, 加入等体积含50%甘油和10mM二硫苏糖醇的预热(37℃)匀浆缓冲液B。
(6). 匀浆10次。
(7). 37℃孵育1小时。
(8). 用2倍体积含10mM二硫苏糖醇的预热(37℃)匀浆缓冲液B稀释。
(9). 匀浆10次。
(10). 25℃下以100000g离心1小时。
(11). 移出含溶解还原酶的上层清液。后者可直接用于光谱测定HMG-CoA还原酶或进一步提纯。
a: 匀浆缓冲液B含10mM蔗糖, 50mM KCl, 40 mM磷酸钾, 30mM KEDTA, pH7.2。
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三、培养细胞的HMG-CoA还原酶
培养细胞的HMG-CoA还原酶活性用去垢剂增溶的全细胞提取物测定, 也可用微粒体。包括两个步骤: (1)试验后收聚细胞并冻存; (2)在测定前准备去垢剂提取物。应注意只有当细胞在缺乏脂蛋白的血清中孵育大约18小时后才会呈现明显活性。
对于悬浮生长细胞: 室温下900g离心3分钟, 悬浮于50mM Tris-HCl, pH7.4及150mM NaCl(1ml/2x106个细胞)中。再离心, 用同样方式洗涤沉淀物一次。沉淀物用液氮冷冻; 用前-70℃存放。
对于贴壁细胞: 将Petri培皿(35mm或60mm)中的培养基弃去。用橡皮淀帚将细胞刮入1ml 50mM Tris-HCl pH7.4/150mM NaCl溶液中。室温下900g离心3分钟, 以同样方式洗涤沉淀物一次, 按悬浮细胞一样将沉淀物冷冻和贮存。