第二节 活性测定
测定HMG-CoA还原酶活性最常用的方法是基于从[3-14C]HMG-CoA形成[3-14C]甲基二羟戊酸 。这是一个敏感的方法, 可用于测定浆膜结合的HMG-CoA还原酶。在反应过程中, 应将前体和产物分开, 以便定量测定所形成的产物, 但分析过程很费时间。为了达到这种分离, 可采用薄层层析、柱层析或纸层析的方法。层析前应加入用3H标记的甲基二羟戊酸, 以校正操作过程中的丢失。这种方法可用于微粒体酶和可溶性53kDa催化域的分析。
也可采用分光光度的方法测定HMG-CoA还原酶的活性。该方法是测定HMG-CoA还原酶依赖性NADPH氧化成NDPH。它只适用于测定还原酶可溶性催化域制备物, 而不适用于微粒体。因为该方法的背景反应明显, 且有光散射性。这种分析方法的优点是快速(不必分离反应产物)和不必使用有放射活性的物质。可应用该方法有效地研究调节HMG-CoA还原酶活性的物质。
一、重要参数
(一)、鼠肝中微粒体酶对HMG-CoA(底物, S)的米氏常数(Km)是1-21uM, 并与动物饲养食物有关。当改变NADPH浓度时, 微粒体酶的动力学曲线呈S形。达到50% 最大速率(S0.5)所需NADPH浓度从40uM到1.3mM而变动。标准的方法是在分析酶活性前将HMG-CoA还原酶与NADPH一起预孵育, 这可使其S0.5增加4-6倍。
(二)、使用磷酸盐缓冲液可使竞争反应降至最低程度, 因该缓冲液可抑制裂解酶的活性。在某些组织中例如肝组织, 存在高活性同质体,若用离心法产生低速的沉淀物和上层清液, 可使这些分部中的还原酶分析结果不可靠。为了检验裂解活性或其他因素是否使甲基二羟戊酸生成减少, 可先分别测定从鼠肝中制备的微粒体和感兴趣的全细胞匀浆物各自的活性, 然后混合在一起进行测定。如果混合后所测定的甲基二羟戊酸量较分别测定的量少, 则提示存在污染性活性(或抑制物)。
(三)、HMG-CoA还原酶的活性受可逆性巯基团氧化还原反应调节。在谷胱甘肽的氧化还原缓冲液中, 鼠肝的HMG-CoA还原酶的还原活性态与氧化无活性态迅速达到平衡状态。为了获得最大的活性, 反应物中应加入巯基化合物。如果不加入巯基化合物, 其活性基本反映所分离酶细胞中巯基/二硫化合物状态。
(四)、HMG-CoA还原酶的活性也受可逆性磷酸化的调节。磷酸化严重地干扰酶的催化活性, 但通过氟敏感的磷酸酶处理后可使其完全恢复, 天然HMG-CoA还原酶的表达活性测定, 反映了酶的磷酸化程度。若同时测定酶脱磷酸化的总活性, 则可获得酶活性的百分值。
(五)、测定各组织中HMG-CoA还原酶活性时, 应建立浓度与时间的反应线性关系。
(六)、应用常规测定蛋白质的方法测定可溶性酶的蛋白浓度。若在微粒体制备过程中使用了二硫化合物, 则应避免蛋白分析时的干扰 。测定膜蛋白浓度时, 应避免蛋白分析时的干扰。测定膜蛋白浓度时, 应避免光散射, 采用改良的Lowry法使膜蛋白完全溶解可达此目的。
(七)、一个酶活性单位的定义是, 一分钟内合成1nmol甲基二羟戊酸所需的量。在进行分光光度分析时, 这相当于使2nmol NADPH转化为NSDP+。
二、放射化学分析时采用(R,S)-(3-14C)HMG-CoA作用为底物。(S)-异构体被还原为甲基二羟戊酸时伴随2分子NADPH氧化为NADP+。反应过程中, 通过6-磷酸葡萄糖脱氢酶使6-磷酸葡萄糖氧化(这是NADP+依赖性的)而维持NADPH浓度恒定。分析用总的反应体积是100ul, 其中含有100mM磷酸钾(pH7.4)、20mM 6-磷酸葡萄糖、2.5mM NADP、1u 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、5mM二硫基化合物和1mM EDTA。分析步骤见方案3。
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方案3. HMG-CoA还原酶放射化学分析法
(1). 样本制备
(a)微粒体制备 解冻肝微粒体沉淀物, 用200mM磷酸缓冲液C (含200mM K2HPO4、2mM EDTA和10mM二巯基化合物, pH7.4)经口径渐细的注射器针使沉淀物分散。
(b)细胞游离提取物制备 解冻成纤维细胞沉淀物, 并用200ul磷酸缓冲液D(含50 mM K2HPO4、5mM二巯基化合物和1mM EDTA, pH7.4)溶解。
(2). 测定酶制备物中的蛋白浓度。
(3). 将1.5ml微量离心管放置冰上, 加入下列溶液, 使其最终体积为100ul。
10ul含25mM NADP和含200mM 6-磷酸葡萄糖;
微粒体制备液: 取相当于60-240ug蛋白的量加入磷酸缓冲液中, 总体积为50ul; 细胞游离提取物制备液: 取40ul (其蛋白量50-100ug), 并加入40ul 200mM磷酸缓冲液。
1单位6-磷酸葡萄糖脱氢酶。
加水至体积为95ul。
(4). 在37℃下孵育15分钟。
(5). 加入5ul底物溶液, 即(R、S)-[3-14C]HMG-CoA(8Ci/mol, 10mM)a, 使其最终浓度为50mM。
(6). 在37℃孵育5-120分钟, 依还原酶的活性而定。
(7). 可用下列溶液终止反应: (a)如果产物是用薄层层析或纸层析进行分析,则加入10ul 5M HCl; (b)若产物用柱层析, 则加入10ul 33%KOH。
(8). 加入[5-3H]甲基二羟戊酸内酯(0.01uCi)和未标记的甲基二羟戊酸内酯(1mg), 以作为内部标准和随后纯化步骤中的载体。将样本在37℃再孵育30分钟, 并用内酯化HCl处理样本。
(9). 对于第(7)步中用KOH终止反应的样本进行酸化处理, 先加入5ul 0.05%溴酚兰, 再加入5M HCl使其颜色变成黄色(约需20-25ul), 孵育30分钟使甲基二羟戊酸完全转化为甲基二羟戊酸丙酯。
a.底物溶液含200ul[3-14C]HMG-CoA(20uCi)、46ul HMG-CoA(10mg/ml)和254ul H2O。
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有效地将前体HMG-CoA与反应产物甲基二羟戊酸分离是至关重要的。下述三种方法均可用于这种分离。
(一)、薄层层析法
薄层层析洗可有效地将HMG-CoA与甲基二羟戊酸分离, 仍然是一种最常采用的方法。分析前, 用微量离心机离心变性蛋白沉淀。将75ul溶液放置在2.0cm宽的道条上, 使用活化硅胶G薄层层析板M(750um厚)在丙酮/苯(1:1)混合液中冲洗。使层析板干燥, 用放射色谱扫描仪定位甲基二羟戊酸(RF=0.7), 也可用碘蒸气扫描。将含有甲基二羟戊酸部分从板上刮下, 并放入计数瓶中。加入10ml闪烁液, 漩涡振摇分散硅胶, 使甲基二羟戊酸溶解, 用闪烁计数器测定放射活性量。在校正计数有效率和甲基二羟戊酸从硅胶中的回收率后, 计算出酶的比活性。
(二)、纸层析法
对于样本数量大的实验来说, 该方法较为适合。它基于甲基二羟戊酸内酯易溶于甲苯, 使酶产物易被下倾式层析法分离。需要一个大的层析箱(250x400x250mm)附有两个蓄水槽和一个能容纳4排(每排14个)闪烁瓶(20ml), 并固定在架子上。将酸化的反应混合液倒入每一纸梳的中心部位。在60℃下使纸完全干燥(约15分钟)。用甲苯闪烁液{2,5-diphenyloxazole 4g/L, 1,4-bis[2-(4-甲基-5 -phenyloxazolyl)]苯}直接将甲基二羟戊酸丙酯洗脱入闪烁瓶中。用10ml洗脱液可萃取70%的产物, 大约需用3 小时。洗脱液增加至20ml, 可使回收率达77%。
(三)、柱层析法
该法可替代薄层层析且更为快速。用KOH中止反应(见前述)并水解未反应的[14C]HMG-CoA。当使用柱层析时, 可使背景计数明显减少。丙酯化的样本在微量 离心机中离心5分钟, 弃掉沉淀的蛋白。在水中制备AGL-X8甲酸酯(200-400孔,Bio-Rad)柱(7x100mm)。将上层清液加入柱中, 用水洗脱。弃掉开始的1.8ml洗脱液, 甲基二羟戊酸丙酯收集到随后的5ml分部中。其中4ml与15ml Aquasol(Beckman)混合, 并进行计数。在校正了计数效率和甲基二羟戊酯丙酯从柱中的回收率后, 计算酶的比活性。
(四)、其他分离方法
尚有多种其他方法可用来将产物与底物分离。不过有些方法较为费时, 且使用大量有害的有机溶剂, 所以不在此介绍。
(三)、HMG-CoA还原酶的分光光度法分析
通过监测由于NADPH的氧化而使350nm的吸收峰下降率来测定可溶性酶的活性。下述的条件是适合用于1ml的比色怀和1cm长光道。反应混合物含:
1. 600ul磷酸缓冲液(300mM KCl, 240mM磷酸钾、6mM EDTA和15mMdithiothreitol, pH6.8)。
2. 100ul 2mM NADPH。
3. 100ul 1mM (R,S)-HMG-CoA。
4. 100ul 已溶解的酶。
5. 100ul水、抑制物或激活物等。
在无HMG-CoA的情况下, 先测定NADPH的氧化速率, 然后测定有两种底物情况下的速率, 并减掉空白管值。